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毕赤酵母和高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因功能及表达调控的研究

作　者: 于爱群
导　师: 李明春
学　校: 南开大学
专　业: 微生物学
关键词: 毕赤酵母高山被孢霉脂肪酸脱氢酶启动子调控蛋白表达
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

多数不饱和脂肪酸，尤其是多不饱和脂肪酸在人类疾病的预防和治疗方面具有重要作用。许多微生物能够积累多不饱和脂肪酸，但是关于其在微生物中的作用的报道相对较少。一些研究证明，在微生物体内，多不饱和脂肪酸也能够行使某些特异功能。但是，对于其在细胞生长发育过程中，具体参与了哪些细胞过程，发挥了哪些细胞功能,目前尚不清楚。因此，有必要进行系统研究。随着人们对于多不饱和脂肪酸需求量的日益增加，急需为多不饱和脂肪酸的生产寻找新的可替代来源。利用产油真菌等微生物发酵生产以及利用转基因方法生产有价值的多不饱和脂肪酸具有广阔的应用前景。要利用微生物发酵技术和转基因技术实现多不饱和脂肪酸的大量和优质生产，首先需要了解该微生物多不饱和脂肪酸合成的信号系统和调控机制。然而，到目前为止，对于多不饱和脂肪酸合成的关键基因—脂肪酸脱氢酶基因表达调控的分子机制的了解还相当少。因此，从分子水平探索脱氢酶基因的表达调控机制显得尤为重要。巴斯德毕赤酵母是表达外源蛋白的理想宿主。与酿酒酵母相比，其体内具有相对完整的多不饱和脂肪酸代谢系统，是研究脂肪酸代谢理想的真核模式菌株。产油丝状真菌高山被孢霉是α-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸和二十碳五烯酸的主要生产菌株。本文选择高山被孢霉ATCC16266作为研究对象，其α-亚麻酸产量可达总脂肪酸的20%以上，是α-亚麻酸生产的优良菌株。为了阐明各种不饱和脂肪酸在微生物生长发育过程中的作用，我们利用同源重组的方法构建毕赤酵母脱氢酶基因缺失株。Fad9A基因或Fad9B基因的单缺失并未影响菌株的正常生长；当两者同时缺失时，引起了菌株的死亡。外源添加油酸恢复了菌株的生长。△Fad12突变株的生长速度明显变慢，而△Fad15突变株生长速度基本没有变化。以上结果显示：与亚油酸和α-亚麻酸相比，油酸对于菌株的生长发育更为重要；亚油酸的缺失也会影响菌株的生长速度，而α-亚麻酸的缺失似乎对菌株的生长影响不大。这些结果也在分子水平上阐明了毕赤酵母不饱和脂肪酸的合成途径，明确了每一步骤中的催化酶类及其编码基因：Fad9A基因和Fad9B基因可能属于同源基因，两者的编码蛋白是同工酶，均能行使△~9-脱氢酶的功能，催化硬脂酸生成油酸；Fad12基因编码产生了△12-脱氢酶，负责将油酸转化成亚油酸；Fad15基因编码产生了△15-脱氢酶，能够在亚油酸的基础上进一步催化脱氢生成α-亚麻酸。同时，我们证明了油酸与毕赤酵母的低温耐受性和乙醇耐受性成正相关关系，而亚油酸和α-亚麻酸可能与毕赤酵母低温耐受性和乙醇耐受性之间没有明显的关系。此外，油酸、亚油酸、α-亚麻酸与毕赤酵母的甲醇耐受性之间没有关系。通过实时定量PCR技术检测了在低温和外源添加脂肪酸条件下毕赤酵母脱氢酶基因mRNA表达水平的动态变化。结果表明，低温对于脱氢酶基因转录的激活作用和外源不饱和脂肪酸对于脱氢酶基因转录的抑制作用都是快速和短暂的，而饱和脂肪酸硬脂酸的添加对于几种脱氢酶基因的表达影响不大。通过构建Fad15基因启动子与lacZ基因的融合载体并测定β-半乳糖苷酶活性的方法来确定在低温和外源脂肪酸刺激下Fad15基因启动子转录活性的变化情况。结果表明，低温能够在短时间内增加PFAD15启动子的活性，而且这种激活作用随着时间的延长而持续增强。PFAD15启动子活性在添加饱和脂肪酸后变化不大；而添加不饱和脂肪酸后，PFAD15启动子活性明显下降，不饱和程度越高，抑制作用越强。而且，不饱和脂肪酸的浓度越高、作用时间越长，抑制作用越强。这一结果与Fad15基因在转录水平上的变化规律并不一致，这说明毕赤酵母脱氢酶基因的表达可能受到细胞内脂肪酸组成变化的反馈调节作用。通过气相色谱法比较了低温和外源脂肪酸刺激后脂肪酸组成的变化情况。结果表明，在低温刺激下，油酸在总脂肪酸中的相对比例表现为持续增加；而亚油酸和α-亚麻酸的相对含量随着时间变化并没有明显的变化规律。同时，在这两种条件下，脱氢酶基因转录水平的变化与对应脂肪酸产物的变化没有相关性。这说明低温和外源不饱和脂肪酸除了在转录水平上调控基因表达发生变化之外，可能主要是在转录后水平上介导了胞内脂肪酸组成的变化。通过同源重组介导敲除的方法构建了毕赤酵母Spt23基因缺失突变株，结果发现Spt23基因缺失严重影响了菌株的生长速度，这说明Spt23p蛋白可能在菌株生长发育过程中起到了重要作用。进一步分析表明Spt23基因缺失突变株生长变缓的原因可能是由于油酸含量的降低所致。实时定量PCR的结果说明：稳定期△Spt23菌株中Fad9A基因和Fad9B基因的相对表达量显著下降、Fad12基因和Fad15基因的相对表达量变化不大。在低温和外源添加不饱和脂肪酸条件下，Spt23基因的存在与否对于Fad12基因和Fad15基因的表达并无影响，所以这两种基因的表达可能并不受Spt23p蛋白的调控。而Spt23基因缺失株Fad9A基因和Fad9B基因的表达变化情况与野生株完全不同，低温的激活作用和外源不饱和脂肪酸的抑制作用消失，说明Spt23p蛋白可能参与了低温和外源脂肪酸对于毕赤酵Fad9A基因和Fad9B基因表达的调控作用。由于对非模式微生物的丝状真菌的遗传操作较为困难，所以，高山被孢霉等产油丝状真菌中多不饱和脂肪酸合成的调控机制至今还不清楚。我们首先利用农杆菌介导T-DNA转化的方法成功构建了高山被孢霉的遗传转化体系，从而为后续的分子遗传操作奠定基础。接下来研究了不同碳源对于高山被孢霉菌体生长、油脂产生以及脱氢酶基因表达的影响情况。结果证实了三种脱氢酶基因的表达以及多不饱和脂肪酸的合成依赖于不同的碳源类型而变化，这可能是机体在面对不同生长条件时所作出的不同的应答反应，也说明了多不饱和脂肪酸的合成同样可能也受到了不同碳源代谢网络的调控。通过实时定量PCR技术和启动子报告基因融合载体的方法，研究低温和外源不饱和脂肪酸对于高山被孢霉三种脱氢酶基因表达随时间进程的影响。实时定量PCR的结果表明：低温对于三种脱氢酶基因的转录具有激活作用，外源不饱和脂肪酸对基因转录起抑制作用，而且这两种作用都是快速响应的，随时间延长逐渐减弱并消失。脂肪酸组成测定结果证明了基因转录水平变化与对应产物变化之间没有相关性。低温能够在短时间内诱导PFAD6启动子活性增加，并随时间延长而持续增强；外源不饱和脂肪酸对PFAD6启动子活性起抑制作用，其不饱和度和浓度越高，抑制作用越强，而且抑制作用是快速且持续的。以上结果说明低温和外源不饱和脂肪酸除了在转录水平上调控脱氢酶基因表达发生变化之外，可能主要在转录后水平上介导了胞内脂肪酸组成的变化。而且，脱氢酶基因的表达可能受到胞内脂肪酸组成变化的反馈调节作用。本文首次在转录水平上对毕赤酵母和高山被孢霉脱氢酶基因的表达调控机制进行了探索，为深入了解产油菌株体内脱氢酶基因表达及多不饱和脂肪酸合成对外界信号的应答机制提供了有用信息，也对应用微生物发酵和转基因技术生产多不饱和脂肪酸具有指导意义。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-18
第一章引言  18-57
  第一节多不饱和脂肪酸的研究概况  18-22
    1.1.1 多不饱和脂肪酸的概述  18
    1.1.2 多不饱和脂肪酸的功能  18-20
    1.1.3 多不饱和脂肪酸的生产  20-22
  第二节多不饱和脂肪酸合成机理的研究  22-27
    1.2.1 脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析  22-23
    1.2.2 脂肪酸脱氢酶的总体特征  23-26
    1.2.3 脂肪酸脱氢酶功能的研究  26-27
  第三节多不饱和脂肪酸合成途径的研究  27-31
    1.3.1 细菌不饱和脂肪酸的合成  27-28
    1.3.2 真菌不饱和脂肪酸的合成  28-29
    1.3.3 哺乳动物不饱和脂肪酸的合成  29-31
  第四节多不饱和脂肪酸合成调控的研究  31-52
    1.4.1 枯草芽孢杆菌脂肪酸脱氢酶基因的表达调控  31-33
    1.4.2 铜绿假单胞菌脂肪酸脱氢酶基因的表达调控  33-34
    1.4.3 集胞蓝细菌脂肪酸脱氢酶基因的表达调控  34-36
    1.4.4 酿酒酵母脂肪酸脱氢酶基因的表达调控  36-45
    1.4.5 哺乳动物脂肪酸脱氢酶基因的表达调控  45-51
    1.4.6 结论和展望  51-52
  第五节选题依据和技术路线  52-57
    1.5.1 选题依据  52-54
    1.5.2 工作背景及研究内容  54-56
    1.5.3 技术路线  56-57
第二章毕赤酵母脂肪酸脱氢酶缺失突变株的构建及功能分析  57-93
  第一节实验材料  57-60
    2.1.1 菌株和质粒  57
    2.1.2 引物  57-59
    2.1.3 主要试剂  59-60
    2.1.4 主要仪器  60
  第二节实验方法  60-72
    2.2.1 培养基的配制  60-61
    2.2.2 试剂的配制  61-62
    2.2.3 毕赤酵母基因组 DNA 的提取  62
    2.2.4 大肠杆菌质粒的 SDS 碱裂解法提取  62-63
    2.2.5 基因敲除用同源重组片段的构建  63-68
    2.2.6 毕赤酵母脂肪酸脱氢酶基因的敲除  68-70
    2.2.7 毕赤酵母脂肪酸脱氢酶基因敲除株的验证  70-71
    2.2.8 毕赤酵母脂肪酸脱氢酶基因敲除株的表型变化  71-72
  第三节结果与分析  72-89
    2.3.1 重组敲除质粒的构建  72-77
    2.3.2 敲除株的分子鉴定  77-82
    2.3.3 敲除株的产物鉴定  82-83
    2.3.4 敲除株的表型分析  83-89
  第四节讨论  89-91
  第五节小结  91-93
第三章不同外界刺激对毕赤酵母脂肪酸脱氢酶基因表达的影响  93-119
  第一节实验材料  93-96
    3.1.1 菌株和质粒  93
    3.1.2 引物  93-95
    3.1.3 主要试剂  95
    3.1.4 主要仪器  95-96
  第二节实验方法  96-101
    3.2.1 培养基的配制  96
    3.2.2 试剂的配制  96-97
    3.2.3 毕赤酵母总 RNA 的提取  97-98
    3.2.4 除去 RNA 中的基因组 DNA  98
    3.2.5 反转录反应  98-99
    3.2.6 Real-time PCR  99
    3.2.7 基因相对表达量的数据分析  99
    3.2.8 启动子报告基因重组载体的构建  99-100
    3.2.9 启动子活性分析  100-101
  第三节结果与分析  101-115
    3.3.1 低温刺激对脂肪酸脱氢酶基因表达和脂肪酸组成的影响  101-105
    3.3.2 外源脂肪酸对脂肪酸脱氢酶基因表达和脂肪酸组成的影响  105-110
    3.3.3 启动子报告基因重组载体的构建及转化  110-112
    3.3.4 低温对启动子活性的影响  112-113
    3.3.5 外源脂肪酸对启动子活性的影响  113-115
  第四节讨论  115-117
  第五节小结  117-119
第四章毕赤酵母脂肪酸脱氢酶基因潜在调控蛋白的研究  119-134
  第一节实验材料  119-122
    4.1.1 菌株和质粒  119
    4.1.2 引物  119-121
    4.1.3 主要试剂  121
    4.1.4 主要仪器  121-122
  第二节实验方法  122-123
    4.2.1 培养基的配制  122
    4.2.2 试剂的配制  122-123
    4.2.3 BLAST 分析  123
    4.2.4 毕赤酵母 Spt23 基因的敲除  123
    4.2.5 Spt23 基因缺失对脂肪酸脱氢酶基因表达的影响  123
  第三节结果与分析  123-130
    4.3.1 BLAST 比对结果  123-124
    4.3.2 Spt23 基因的缺失株的鉴定  124-126
    4.3.3 Spt23 基因缺失对菌株生长的影响  126-127
    4.3.4 Spt23 基因缺失对脂肪酸脱氢酶基因表达和脂肪酸合成的影响  127-130
  第四节讨论  130-132
  第五节小结  132-134
第五章农杆菌介导高山被孢霉遗传转化体系的研究  134-151
  第一节实验材料  134-136
    5.1.1 菌株和质粒  134
    5.1.2 引物  134-135
    5.1.3 主要试剂  135
    5.1.4 主要仪器  135-136
  第二节实验方法  136-142
    5.2.1 培养基的配制  136
    5.2.2 试剂的配制  136-138
    5.2.3 潮霉素 B 对高山被孢霉抑菌浓度的确定  138
    5.2.4 紫外诱变法筛选高山被孢霉潮霉素 B 敏感菌株  138
    5.2.5 双元载体 pBI/hpt 的构建  138-139
    5.2.6 利用三亲杂交法将双元载体 pBI/hpt 转入农杆菌中  139-140
    5.2.7 农杆菌转化高山被孢霉及其检测  140-142
  第三节结果与分析  142-147
    5.3.1 高山被孢霉在含有潮霉素 B 的不同培养基的生长情况  142-143
    5.3.2 紫外诱变筛选高山被孢霉潮霉素 B 敏感菌株  143-144
    5.3.3 双元载体 pBI/hpt 的构建  144-145
    5.3.4 双元载体 pBI/hpt 转化农杆菌  145-146
    5.3.5 高山被孢霉转化子的 PCR 鉴定  146-147
    5.3.6 高山被孢霉转化子的 Southern blot 分析  147
  第四节讨论  147-149
  第五节小结  149-151
第六章不同外界刺激对高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因表达的影响  151-178
  第一节实验材料  151-155
    6.1.1 菌株和质粒  151
    6.1.2 引物  151-154
    6.1.3 主要试剂  154-155
    6.1.4 主要仪器  155
  第二节实验方法  155-160
    6.2.1 培养基的配制  155-156
    6.2.2 试剂的配制  156-157
    6.2.3 高山被孢霉生物量、油脂产量及组成的测定  157
    6.2.4 Real-time PCR 检测高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因的相对表达  157
    6.2.5 高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因 5’端上游区域的扩增  157-159
    6.2.6 报告载体的构建及转化酿酒酵母  159-160
    6.2.7 启动子活性分析  160
  第三节结果与分析  160-173
    6.3.1 不同碳源对菌株生长、油脂产生及脂肪酸脱氢酶基因表达的影响  160-165
    6.3.2 低温刺激和外源脂肪酸对脂肪酸脱氢酶基因表达的影响  165-167
    6.3.3 高山被孢霉 Fad6 基因 5’端上游区域的扩增  167-169
    6.3.4 重组表达载体 pYEP356-PFAD6的构建及转化  169-170
    6.3.5 低温对启动子活性的影响  170-171
    6.3.6 外源脂肪酸对启动子活性的影响  171-173
  第四节讨论  173-176
  第五节小结  176-178
第七章结论与展望  178-182
  第一节结论  178-180
  第二节主要创新点  180-181
  第三节相关工作的前景展望  181-182
参考文献  182-194
致谢  194-195
个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果  195-197

毕赤酵母和高山被孢霉脂肪酸脱氢酶基因功能及表达调控的研究

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