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同源异型盒基因PttKN1在几种花卉植物中的遗传转化及其功能研究

作　者: 徐全乐
导　师: 王新宇；王崇英
学　校: 兰州大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 彩叶草红叶甜菜花序浸染法 KNOX基因 PttKNI基因生长素维管组织叶序遗传转化竹节海棠
分类号: S68
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

植物的形态发生可以追溯到顶端分生组织活性。在目前已鉴定参与分生组织活性调控的众多基因中,KNOX基因(KNOTTED1-like homeobox genes)被认为是非常重要的一员。目前,关于KNOX基因研究的主要结果来自于草本植物,对木本植物来源的KNOX基因功能还知之甚少。为了进一步研究木本植物来源的KNOX基因在植物形态发生和分生组织调控中的作用,以及探讨通过转基因途径筛选新、奇、特花卉植物品系的可能性,本研究采用农杆菌介导的叶盘法和花序浸染法,用来自杨树维管束形成层的一个KNOX同源基因,PttKNI(Populus tremula×tremuloidesKNOTTED1)转化花卉植物竹节海棠、红叶甜菜和彩叶草,获得了许多表型上与野生型明显不同的植株,进而从形态学、解剖学、生理学及分子生物学水平分析了PttKNI基因的异位表达对这些植物发育的影响,其主要结果如下:1.采用叶盘转化法转化竹节海棠,初选共获得168株卡那霉素抗性植株,表型表现为叶缘缺刻型、杯状叶型、异常叶序型、异源小叶型、珊瑚型等,其中异源小叶型具有一定的观赏价值。每种类型随机取两株进行RT-PCR分析,初步表明PttKNI基因已经插入到这些“转基因”植株基因组中;石蜡切片和扫描电镜分析显示,异源小叶型植株的叶片表面和叶序异常型植株的茎上均有异源分生组织形成。2.采用花序浸染法首次转化非十字花科植物红叶甜菜,初选共获得132株卡那霉素抗性植株,其中绿色苗65株,红色苗67株。绿色苗中表型有三子叶型、花茎顶端产生新茎型、多主花序茎型、扁花序茎型、异源芽花序茎型和类野生型,频率分别为0.12%、0.18%、0.18%、0.13%、0.12%和3.18%;红色苗中表型有单子叶型、三子叶型、四子叶型、子叶融合型、下胚轴异常型、叶皱缩型、叶缘缺刻型、扁花序茎型和多主花序茎型,频率分别为0.18%、0.72%、0.06%、0.12%、0.06%、1.62%、0.96%、0.26%和0.06%,其中绿色类野生型植株具有一定的观赏价值;对红色三子叶型、子叶融合型和下胚轴异源分生组织型各一株进行PCR分析,其结果均显示相同的PCR特异条带;以绿色形态正常型植株进行自交,后代均表现为绿色;以野生型(紫红色)为母本,绿色形态正常株为父本,其后代均表现为紫红色;以绿色形态正常株为母本,野生型为父本,后代紫红色与绿色苗大致比例为3:2;绿色形态正常株内源激素分析表明,生长素水平与野生型基本相当,细胞分裂素水平比野生型稍高;电子显微镜观察绿色形态正常株叶绿体结构发现,同野生型相比,叶绿体内部基粒类囊体的数目有所增加;对红色三子叶苗的显微结构分析显示,顶端分生组织形态由原来的椭圆形改变为三角形,下胚轴导管之间形成约120度的夹角(野生型中为平行排列);内源激素测定还显示,红色三子叶型的生长素水平约为野生型植株的二倍。3.用花序浸染法转化非十字花科植物彩叶草,初选共得到15株卡那霉素抗性植株,表型有叶面结瘤型、叶表凹凸型、叶缘缺刻型、株形簇生型、叶序轮生(六棱形茎)型,频率分别为1.0%、0.67%、2.33%、0.67%和0.33%,其中轮生叶序型具有一定的观赏价值。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略词表  11-12
第一章前言  12-25
  一.KNOX基因的研究概况  12-22
    1.植物中的同源异型盒基因  12-14
    2.KNOX基因的编码蛋白  14
    3.KNOX基因的表达模式  14-16
    4.KNOX基因与植物发育  16-17
    5.KNOX基因与次生生长  17-19
    6.KNOX基因与激素  19-20
    7.KNOX基因与植物叶序  20-21
    8.KNOX基因对拟南芥发育的调控模型  21-22
  二.PttKN1基因  22-23
  三.本研究的目的及意义  23-25
第二章 PttKNI基因在竹节海棠中的遗传转化及功能分析  25-35
  一.材料与方法  25-28
    1.实验材料  25
    2.竹节海棠离体再生体系的建立  25-26
    3.农杆菌叶盘法介导的PttKN1基因的遗传转化  26-27
    4.形态学观察  27
    5.RT—PCR鉴定  27
    6.显微结构观察  27-28
    7.扫描电镜观察  28
  二.实验结果  28-32
    1.竹节海棠高频离体再生体系的建立  28-29
    2.基因转化  29-30
    3."转基因"植株表型分析  30
    4.RT—RCR分析  30-31
    5.转基因苗的显微结构分析  31
    6.转基因苗的扫描电镜分析  31-32
  三.讨论  32-35
    1.PttKNI基因具有很强的分生组织起始活性  32
    2.PttKNI基因能够影响叶序的形成  32-33
    3.PttKNI转基因竹节海棠具有多效性表型  33-35
第三章 PttKN1基因在红叶甜菜中的遗传转化及功能分析  35-53
  一.材料与方法  35-38
    1.实验材料  35
    2.遗传转化  35
    3.转化苗初选  35
    4.PCR鉴定  35-36
    5.转基因植株组织学分析  36
    6.内源激素水平测定  36-37
    7.叶绿体超微结构观察  37
    8.遗传学分析  37-38
  二.实验结果  38-45
    1.红叶甜菜转化体系的建立  38-39
    2.卡那霉素抗性植株表型分析  39-42
    3.转基因红叶甜菜的PCR分析  42
    4.三子叶转基因植株和抗性花序茎扁茎植株的组织学分析  42-44
    5.抗性绿色植株和三子叶转基因苗的内源生长素含量的比较  44
    6.抗性绿色植株的遗传学分析  44
    7.外源激素处理对抗性绿色植株的影响  44-45
    8.抗性绿色植株的叶绿体数目与结构的分析  45
  三.讨论  45-53
    1.花序浸染法的相关参数对红叶甜菜转化效率的影响  45-46
    2.PttKN1基因的异源表达对红叶甜菜叶序的影响  46-50
    3.PttKN1基因的异源表达对红叶甜菜花序茎形态和结构的影响  50-52
    4.对红叶甜菜植株颜色的影响  52-53
第四章 PttKN1基因在彩叶草中的遗传转化及功能分析  53-57
  一.材料与方法  53
    1.实验材料  53
    2.农杆菌介导的花序浸染法对彩叶草的转化  53
    3.抗性植株的筛选与移栽  53
  二.实验结果  53-55
    2.1 抗性植株的筛选  53-54
    2.2 抗性植株的表型分析  54-55
  三.讨论  55-57
第五章结论与展望  57-60
  一.结论  57-58
  二.问题与展望  58-60
参考文献  60-72
图版说明  72-78
图版  78-90
致谢  90-91
在读期间发表及待发表文章情况  91

同源异型盒基因PttKN1在几种花卉植物中的遗传转化及其功能研究

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