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来氟米特对肝星状细胞增殖的抑制及分子作用机制

作　者: 司洪芳
导　师: 李俊
学　校: 安徽医科大学
专　业: 药理学
关键词: 来氟米特瘦素星状细胞增殖枯否细胞 I型胶原凋亡血小板衍化生长因子细胞因子丝裂原激活的蛋白激酶肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

肝纤维化是许多慢性致病因素作用于肝脏引起ECM过量沉积的伤愈合过程，激活的HSC是产生ECM的主要来源细胞。HSC从静止向激活状态的转化是肝纤维化发生的一个中心环节。相邻活化的Kupffer细胞和损伤的肝细胞通过释放各种细胞因子和活性氧（reactive oxygen species，ROS）而参与HSC活化过程。此针对HSC的抗肝纤维化治疗将成为治疗肝纤维化的关键步骤。目前针对HSC的治疗主要集中于抑制HSC激活、增殖及胶原合成、促进胶原降解几方面。因此，为了进一步探讨来氟米特（leflunomide，Lef）对肝纤维化的作用机制，我们将深人研究HSC活化的分子机制，揭示更多来氟米特干预HSC活化的作用靶点。研究主要是从细胞因子这个角度进行开展，主要以两个重要的肝纤维化细胞因子瘦素和PDGF的信号转导通路为关键环节，为临床防治肝纤维化提供新方法、新线索。研究内容主要包括以下三个部分：1．Lef对CCl₄／leptin诱导的肝纤维化的影响动物实验研究表明，Lef预防给药(1、3、9 mg·kg^-1，ig)可显著降低血清转氨酶活性，血清透明质酸及肝组织羟脯氨酸的含量水平；免疫组化显示，Lef亦可明显抑制大鼠肝脏内Ⅰ型胶原及a-SMA的蛋白表达水平；提示Lef预防给药对CCl₄／leptin诱导的肝纤维化具有明显的保护作用。体外研究发现，一定浓度的外源性瘦素能明显刺激HSC活化并发生表型改变，刺激其增殖和Ⅰ型胶原的合成。特定的化学抑制剂（AG490、PD098095、LY294002）表明，瘦素是通过激活Janus激酶／信号转导与转录激活因子（Janus kinase／signal transducer and activator oftranscription，JAK／STAT）、分裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷酸肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，P13-K）通路而传递信号的。流式细胞术与³H-TdR掺入实验表明，来氟米特的活性代谢物A771726可通过阻断瘦素受体的信号转导而显著抑制Ⅰ型胶原的分泌。而且与HSC增殖密切相关的cyclin D1周期蛋白的表达也明显地被来氟米特所抑制。另一方面，A771726可显著抑制瘦素诱导的枯否细胞的活化及枯否细胞条件培养基所刺激的HSC胶原蛋白的合成。以上实验结果综合说明了来氟米特在肝炎症和纤维化中的新的作用机理。2．体外Lef通过阻断PDGF-BB引起的MAPK蛋白的活化而抑制HSC增殖本研究结果表明CCl₄慢性损伤的KC细胞经LPS诱导后其条件培养液（KCCM）可显著促进HSC的增殖，PDGFR-β受体的表达，PDGFR-β受体的酪氨酸磷酸化以及PDGF受体介导的MAPK蛋白激酶家族的活化（p38、ERK、JNK）。本研究还发现Kupffer细胞的培养上清对HSC的这种促增殖作用可显著被抗PDGF-BB中和抗体所阻断，提示PDGF-BB在促肝星状细胞增殖上的关键作用。A771726的预处理对PDGF-BB依赖性的DNA合成有显著的抑制作用。这种作用主要是通过抑制PDGF-BB介导的促细胞有丝分裂信号转导通路中的PDGFR-β受体本身酪氨酸激酶的活性，从而导致MAPK活性的下降，抑制HSC的增殖。3．体外Lef通过诱导凋亡而抑制HSC增殖HSC的激活、增殖是肝纤维化发生的一个中心环节，然而诱导或促进激活的HSC凋亡可避免或减少HSC聚积，这也可能成为抗肝纤维化治疗的重要对策。本部分将以HSC为靶标，主要集中探讨A771726对HSC增殖、活化的抑制及对HSC凋亡的诱导。本研究结果发现，CCl₄慢性损伤的KC细胞经LPS诱导后其条件培养液（KCCM）可显著促进HSC的增殖，此过程伴随着PDGFR-β与DR5细胞因子受体的表达。A771726的干预可明显抑制HSC增殖，同时诱导其凋亡。简言之，KCCM的刺激可显著增加PDGFR-β受体的酪氨酸磷酸化以及PDGF受体介导的IAK／STAT、MAPK信号转导通路的活化。特定的化学抑制剂（AG490、PD098095）表明，JAK₂蛋白激酶在促STAT₃、ERK1／2酪氨酸磷酸化中起主导作用。A771726的预处理可显著阻断它们的活化。而且与HSC增殖密切相关的周期蛋白的表达也明显地被A771726所抑制。另一方面，A771726可显著上调HSC细胞表面DR5凋亡受体的表达，增加其丰度。这个过程伴随着Procaspase 8酶原激活，从而导致其下游的Bid蛋白的裂解，调亡负调控蛋白Bcl-2的切割，最终导致促调亡因子细胞色素C（Cytochrome c）的释放。以上实验结果综合说明了抑制HSC增殖并同时诱导其凋亡是来氟米特在肝炎症和纤维化中的新的作用机制。

全文目录

中英文缩写词对照  6-8
中文摘要  8-11
英文摘要  11-14
1 前言  14-15
2 实验材料  15-20
  2.1 动物  16
  2.2 药品与试剂  16-19
  2.3 仪器与设备  19-20
  2.4 图象分析软件  20
3 实验方法  20-45
  3.1 动物的处理和模型的建立  20
  3.2 大鼠肝星状细胞和枯否细胞的分离、培养  20-22
  3.3 丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)  22-23
  3.4 KC条件培养基(KCCM)的制备  23
  3.5 细胞DNA合成测定(~3H-TdR/~3H-Pro掺入法)  23-24
  3.6 透明质酸ELISA测定方法  24-25
  3.7 双抗夹心ELISA法测定TGF-β1、TNF-α、IL-6的含量  25-26
  3.8 肝组织羟脯氨酸含量测定  26-27
  3.9 大鼠Ⅰ型胶原、α-SMA免疫组织化学检测  27-28
  3.10 ELISA法定量测定Ⅰ型胶原  28
  3.11 Caspase-3活性分析  28-30
  3.12 Bradford蛋白浓度测定  30
  3.13 流式细胞仪检测细胞周期(碘化丙啶染色法)  30
  3.14 HSC总RNA提取(Trizol法)  30-31
  3.15 Real Time PCR扩增的操作步骤  31-32
  3.16 Western印迹法  32-39
  3.17 非放射性凝胶迁移试验(EMSA)  39-45
4 实验结果  45-82
  4.1 Lef对CCl_4/leptin诱导慢性肝纤维化的影响  45-50
  4.2 体外研究  50-61
  4.3 体外Lef的活性代谢物(A771726)通过阻断PDGF-BB引起的MAPK蛋白的活化而抑制HSC增殖  61-69
  4.4 体外Lef的活性代谢物(A771726)通过诱导凋亡而抑制HSC增殖  69-82
5 讨论  82-87
结论  87-88
参考文献  88-96
附录  96-97
致谢  97-98
综述  98-117
  参考文献  110-117

来氟米特对肝星状细胞增殖的抑制及分子作用机制

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