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内蒙古三种棘豆属植物中苦马豆素相关因子的研究

作　者: 卢萍
导　师: 赵萌莉；韩国栋
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 草畜种质资源学
关键词: 棘豆属遗传多样性内生真菌苦马豆素 LC-MS 5.8SrDNA ITS
分类号: S567.239
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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引　用: 9次
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内容摘要

棘豆属(Oxytropis)的小花棘豆(O.glabra)、刺叶柄棘豆(O.aciphylla)、砂珍棘豆(O.racemusa)在内蒙古的草原区和荒漠区广为分布,它们不仅是有药用价值的经济植物,还有重要的生态和饲用价值。其中小花棘豆对牲畜而言是毒草,然而其有毒成分苦马豆素却是很有潜力的抗肿瘤药物。本研究采用高效液相色谱-质谱联用(LC-MS)法测定了三种棘豆植物的苦马豆素含量;通过ISSR分子标记技术对三种棘豆种群遗传多样性及其苦马豆素相关标记进行了研究;将小花棘豆植物单株进行体外真菌培养,研究了菌落和分生孢子的微生物形态学特性,从植物总DNA和相同植株培养的真菌总DNA扩增真菌的5.8SrDNA/ITS区,进行了DNA序列分析与排序;联系单株小花棘豆的苦马豆素含量测定和内生真菌ITS序列分析结果,与从美国分布的二种棘豆(O.lambertii、O.sericea)和一种黄芪(A.mollisimus)中分离的内生真菌埃里砖格孢属Embellisia sp.L12株得到的结果进行了比较。研究结果表明:刺叶柄棘豆、砂珍棘豆各种群均未测出苦马豆素,也未扩增出上述真菌特异条带,二种棘豆不会导致家畜中毒,因而不是疯草。小花棘豆6个地理种群90株中有65株扩增出上述真菌特异条带,其中51株测出苦马豆素,含量随种群、不同植株变化很大,小花棘豆是疯草;其变种细叶小花棘豆伊金霍洛OY2种群未测出苦马豆素,也未扩增出上述真菌特异条带,而同地采集的小花棘豆却测出苦马豆素,细叶小花棘豆对牲畜无毒。ISSR-PCR扩增条带表现了三种棘豆各种群具有丰富的多态性,种群间的差异主要是基因频率不同,在不同种群中也有一些特异位点。遗传多样性分析表明三种棘豆都存在着较高的遗传多样性,且种群内的遗传变异是主要成分。小花棘豆6个种群的14个ISSR引物的扩增图谱中,没有发现含苦马豆素的植株有特异的ISSR的扩增条带。分子生物学与微生物学的相关研究表明体外培养的内蒙古小花棘豆内生真菌属于Embellisia属真菌。比较内生真菌5.8SrDNA/ITS扩增和宿主苦马豆素含量测定的结果,发现多数小花棘豆中有内生真菌与植物含苦马豆素之间相对应。通过对小花棘豆10株内生真菌与A.mollisimus、O.lambertii和O.sericea的内生真菌Embellisia sp.L12株的的5.8SrDNA/ITS序列分析发现,全长517bp的10个内蒙古小花棘豆的序列完全相同,10个序列与Embellisia sp.L12株的序列只有1个碱基的差异,位于5.8SrDNA区,而ITS1、ITS2区高度保守,11个5.8SrDNA/ITS序列一致度很高。该内生真菌的物种鉴定需要继续深入研究。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-10
1 引言  10-25
  1.1 三种棘豆属植物的研究概况  10-14
    1.1.1 植物学及生态学研究  10-12
    1.1.2 疯草有毒及药用成分-苦马豆素的研究  12-14
    1.1.3 棘豆属植物所含其它化学成分的研究  14
  1.2 分子生物学技术在植物遗传多样性研究中的应用  14-19
  1.3 植物内生真菌(Fungal endophytes)的研究概况  19-25
  1.4 本研究的目的、意义  25
2 材料和方法  25-38
  2.1 研究材料  25-26
    2.1.1 小花棘豆  25-26
    2.1.2 刺叶柄棘豆  26
    2.1.3 砂珍棘豆  26
  2.2 采样地概况  26-31
    2.2.1 采样地的基本情况  26
    2.2.2 采样地的植被情况  26-31
  2.3 研究方法  31-38
    2.3.1 三种棘豆不同植物种群中苦马豆素的提取和测定  31-32
    2.3.2 ISSR 分析  32-34
    2.3.3 植物内生真菌的研究  34-38
3 棘豆植物种群中苦马豆素(Swainsonine)的含量测定分析  38-42
  3.1 棘豆植物种群中苦马豆素含量的LC-MS 测定  38
  3.2 结果与讨论  38-42
4 三种棘豆属植物遗传多样性及与苦马豆素相关分子标记的研究  42-76
  4.1 三个棘豆物种的遗传多样性  42-64
    4.1.1 小花棘豆不同地理种群遗传多样性与遗传分化  42-52
    4.1.2 刺叶柄棘豆不同地理种群遗传多样性与遗传分化  52-63
    4.1.3 砂珍棘豆不同地理种群遗传多样性与遗传分化  63-64
  4.2 苦马豆素相关分子标记的探索  64-74
  4.3 讨论  74-76
5 三种棘豆的内生真菌及其与苦马豆素的相关性研究  76-86
  5.1 从小花棘豆总DNA 扩增真菌5.851DNA/ITS 区与PCR 产物限制酶切反应  76-77
    5.1.1 从小花棘豆总DNA 扩增真菌5.851DNA/ITS 序列  76-77
    5.1.2 PCR 产物的AvaII 限制性内切酶反应  77
  5.2 真菌5.851DNA/ITS 产物的序列测定与分析  77-82
    5.2.1 5.851DNA/ITS 扩增产物的序列测定  77-79
    5.2.2 5.851DNA/ITS 扩增产物的序列分析  79-82
  5.3 从细叶小花棘豆单株总DNA 中扩增真菌5.851DNA/ITS  82
  5.4 从刺叶柄棘豆和砂珍棘豆池DNA 中扩增真菌5.851DNA/ITS  82
  5.5 小花棘豆内生真菌的体外培养及微生物学鉴定  82-83
    5.5.1 小花棘豆内生真菌的体外培养  82-83
    5.5.2 小花棘豆内生真菌的形态特点  83
  5.6 体外培养小花棘豆内生真菌的5.851DNA/ITS 序列扩增与PCR 产物测序  83
    5.6.1 内生真菌的总DNA 提取  83
    5.6.2 内生真菌5.851DNA/ITS 序列扩增和PCR 产物测序  83
  5.7 讨论  83-86
6 结论与展望  86-89
  6.1 主要结论  86-88
  6.2 创新点  88
  6.3 展望  88-89
致谢  89-90
参考文献  90-106
图版说明  106-107
图版  107-116
作者简介  116

内蒙古三种棘豆属植物中苦马豆素相关因子的研究

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