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马传染性贫血病病毒的基因变异与生物学特性研究

作　者: 周涛
导　师: 童光志；陈焕春
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 马传染性贫血病毒感染性分子克隆长末端重复序列表面糖蛋白抗体反应病毒载量实时定量PCR/RT-PCR 启动子活性体内体外
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

马传染性贫血病病毒(EIAV)，慢病毒属成员，主要引起马属动物慢性、终生感染，以周期性发热、病毒血症、贫血和血小板减少为特征。70年代，EIAV弱毒疫苗通过以下策略成功研制：首先，将马强毒EIAV-L经过驴体体内传代113次，获得了高毒力的驴强毒EIAV-DA；然后，将EIAV-DA经驴白细胞体外传125代，获得弱毒疫苗EIAV-DLA，该疫苗可保护马和驴免受同源和异源的野生型高毒力EIAV的攻击。中国EIAV的弱化过程可以为研究其他慢病毒疫苗提供有益借鉴，然而EIAV-L和EIAV-DLA的分子生物学特性还有待澄清。基于这个原因，本研究中将7匹试验马分别接种EIAV-DLA、vOK8266、vOK8266chltr或者空白对照，之后用EIAV-L对所有试验马进行攻击。vOK8266是EIAV-DLA的感染性分子克隆(命名为pOK8266)的衍生病毒。将pOK8266的5’和3’LTR替换成EIAV-L的5’和3’LTR得到嵌合感染性分子克隆(命名为pOK8266chltr)，vOK8266chltr则是pOK8266chltr的衍生病毒。攻毒前后，对每种病毒的体内复制动力学以及抗gp45、p15、p26、p11和p9抗体进行定期监测。此外，对于EIAV两个重要的基因长末端重复序列(LTR)和表面糖蛋白(gp90)的基因型与表型的关系进行探讨。具体研究内容如下：1、免疫期和攻毒期观察试验马EIA疾病进展7匹血清抗EIAV抗体阴性马分别命名为1#、2#、4#、5#，6#、7#和8#。4#和5#接种克隆毒vOK8266，6#和7#接种嵌合毒vOK8266chltr，8#接种疫苗毒EIAV-DLA，1#和2#为接种对照。6个月后，对5匹接种马和2匹接种对照马以野生型强毒EIAV-L攻击。攻毒前后，每天观察各试验马直肠温度和临床症状。免疫期的6个月中，各试验马没有出现发热现象，表明各接种毒株对试验马是安全的，即使vOK8266chltr的LTR是来源于强毒EIAV-L的。攻毒后，1#、2#和7#出现典型的马传贫症状，经过数个发热期后死亡，其余各试验马在攻毒后13个月的观察期内没有出现任何发病症状。2、马体内EIAV的复制动力学为了研究每种病毒在试验马体内的复制情况，攻毒前后对各试验马血浆中病毒RNA载量和外周血单核细胞(PBMC)前病毒DNA载量进行了定期检测。进行检测之前，首先建立了用于检测EIAV基因组的realtime PCR和realtime RT-PCR的标准曲线。攻毒前的大多数时期，vOK8266chltr接种的试验马血浆RNA载量为每毫升血浆10~4到10~5拷贝，比vOK8266和EIAV-DLA接种的试验马在同时期的血浆RNA载量要高，后两者的RNA载量一般低于10~4拷贝。结果表明EIAV-L的LTR比EIAV-DLA在体内有更高的启动子活性。然而，并没有发现PBMC前病毒DNA载量有类似的差异。攻毒后，与未发病马相比，发病马血浆在发热期含有高得多的病毒RNA载量(高于每毫升10~6拷贝)，而在发热间歇期，病毒RNA载量也高于每毫升血浆10~5拷贝。结果表明高水平的病毒复制可促进疾病进展。攻毒3个月后，多数未发病马检测不到血浆病毒RNA，表明在这些未发病马体内病毒复制受到抑制。然而，攻毒前后的任何采样时期，在发病马和未发病马体内都能检测到前病毒DNA。体内前病毒DNA的持续存在对EIAV持续感染的作用有待于进一步研究。3、抗体反应为了评价感染动物对疫苗毒和强毒的免疫反应，攻毒前后，利用ELISA方法定期检测所有试验马针对病毒gp45、p15、p26、p11和p9的特异性抗体。免疫后，4#和5#体内的抗gp45、p15和p26的抗体早于或高于其它试验马，可能是由于vOK8266chltr在马体内的复制水平高于vok8266和EIAV-DLA。攻毒后，发病的1#和7#体内抗gp45，p15和p26的抗体很快达到峰值并一直维持在高水平，而2#在大多数抗体产生前死亡。与之不同的是，除6#外，其余未发病马体内抗gp45，p15，p26，p11和p9的抗体水平在攻毒后一直不高。攻毒前后，未发病的6#与发病的7#有着相似的抗体水平，这可能是由于它们都接种vOK8266并都用EIAV-L攻击所致。以上结果表明，高的抗体水平与试验马的保护之间没有必然联系。p11和p9抗体只有在攻毒后的发病马体内能被检测到，提示这两种抗体的产生可能预示着EIA的疾病进展。4、体内和体外前病毒gp90的变异趋势病毒gp90和LTR是EIAV基因组变异最大的区域，两者对病毒致病性都起着重要作用。了解这两个基因的变异趋势对研究EIAV控制策略是至关重要的。攻毒前后从定期采集自1#，4#(或5#)，7#和8#的白细胞样品中提取总DNA，巢式PCR扩增包含前病毒gp90基因高变区2(V2)到高变区5(V5)的片段。对免疫期获得的序列进行比较分析，结果表明EIAV-DLA的gp90是一个准种，而在EIAV-DLA接种马体后它会变为一个更为复杂的准种。在8#体内，EIAV-DLA序列有向EIAV-L突变的趋势，提示我们可能存在EIAV-DLA毒力返强的危险。免疫了vOK8266和vOK8266chltr的试验马体内病毒gp90也有类似的变化。所有试验马用EIAV-L攻击后，只有EIAV-L的序列被克隆到。发病马体内病毒gp90发生了高度的序列变异，且变异比较集中于V3区，而未发病马体内的gp90只有中等程度的变异。新的发热期伴随着新gp90准种的出现，新准种带有大量的PND变异，提示PND的突变可能对病毒逃避宿主免疫系统的监视起重要作用，免疫逃避可以造成EIAV持续性感染和促进疾病进展。病毒gp90序列的ds／dn值表明机体对病毒的免疫选择压力在发病马的慢性感染期是强阳性的，但是未发病马的免疫选择压力一直较弱。此外，只有在未发病马体内获得了大量gp90缺陷突变体，这可能是使病毒复制水平降低而使感染马存活的原因之一。突变产生的终止密码子多数位于V4区的缺陷“热点”。5、体内和体外前病毒LTR的变异趋势分别从感染EIAV-DA或EIAV-DLA的体外培养驴MDM、感染EIAV-L的马PBMC、定期采集的试验马1#，4#和8#的PBMC等样品中半巢式PCR扩增前病毒LTR。从EIAV-L、EIAV-DA和EIAV-DLA中分别获得11、10和14个LTR序列，比较结果表明LTR-L和LTR-DA都为单一序列，而LTR-DLA则是一个由不同序列构成的准种，提示我们病毒在体外传代弱化的过程是LTR-DLA复杂准种形成的主要原因。在LTR-DLA的U3和R区分别定义了两个高变区。有意思的是LTR-DLA准种接种8#后，LTR-DLA12被迅速选择为优势序列并且此后高度保守。从1#和4#获得的序列也表明LTR在病毒的体内感染过程中是高度保守的。6、不同EIAV毒株LTR的启动子活性研究为了阐明LTR-DLA的高变区A和B的突变对LTR功能的影响，分别从EIAV-L、EIAV-DA和EIAV-DLA中选择1个或2个具有代表性的LTR序列，构建pLTR／CAT系列质粒。通过EIAV-L的LTR R区替换EIAV-DLA的R区获得了2个嵌合pLTR／CAT质粒。在加或不加EIAV-L Tat表达质粒的情况下，pLTR／CAT质粒转染马单核巨噬细胞。结果表明，在体外培养细胞中，所有LTR的基础转录活性都很低，并且它们之间的差异不显著。在共转染Tat表达质粒时，LTR-DLA较EIAV-L和EIAV-DA有更高的LTR启动子增强活性。强弱毒LTR的嵌合体pLTR／CAT质粒的转染结果表明，强弱毒LTR之间启动子活性差异主要是由R区的序列差异造成的，与U3区序列关系不大。特别是LTR TAR起始位置从强毒到弱毒的突变(A到G)改变了TAR的二级结构，这可能会影响Tat与TAR的相互作用。此外，在U3-R交界处发生的核苷酸变异可能会对病毒RNA的合成产生影响。

全文目录

摘要  7-10
Abstract  10-14
缩略语表(Abbreviation)  14-16
第1章文献综述  16-35
  1.1 马传染性贫血病病毒概述  16-20
    1.1.1 慢病毒属的构成  16
    1.1.2 EIAV的历史及分类地位  16-17
    1.1.3 EIAV的形态和理化特性  17
    1.1.4 EIAV的血凝性  17
    1.1.5 EIAV的细胞嗜性和体外培养  17
    1.1.6 EIAV的致病性  17-18
    1.1.7 EIAV检测技术的发展  18-20
  1.2 EIAV的分子生物学研究进展  20-32
    1.2.1 EIAV的基因组结构概述  20-21
    1.2.2 表面糖蛋白gp90  21-22
    1.2.3 穿膜蛋白gp45  22-23
    1.2.4 EIAV gp90和gp45的变异  23-24
    1.2.5 机体针对gp90和gp45的免疫应答  24-25
    1.2.6 EIAV gag蛋白概述  25-27
    1.2.7 机体针对gag的免疫应答  27-28
    1.2.8 非编码区LTR的序列特征  28-29
    1.2.9 LTR与细胞因子的相互作用  29-30
    1.2.10 LTR影响病毒的细胞嗜性  30
    1.2.11 LTR对病毒致病性影响的研究  30-31
    1.2.12 Tat蛋白对LTR启动子活性的影响  31-32
  1.3 反向遗传操作研究EIAV  32-33
  1.4 慢病毒疫苗的研究进展  33-35
第2章研究目的与意义  35-36
第3章材料与方法  36-55
  3.1 试验材料  36-41
    3.1.1 毒株  36
    3.1.2 细胞  36
    3.1.3 试验动物  36
    3.1.4 质粒与菌株  36-37
    3.1.5 细胞培养用试剂  37
    3.1.6 细菌培养用试剂  37-38
    3.1.7 大肠杆菌感受态制备用试剂  38
    3.1.8 操作核酸用试剂  38-39
    3.1.9 寡核苷酸引物与探针  39
    3.1.10 ELISA缓冲液和包被蛋白  39-40
    3.1.11 β-gal和CAT定量检测试剂盒  40
    3.1.12 其他试剂  40
    3.1.13 仪器与器材  40-41
    3.1.14 生物软件  41
  3.2 试验方法  41-55
    3.2.1 细胞的制备与培养  41
    3.2.2 EIAV接种细胞  41-42
    3.2.3 EIAV接种试验马  42
    3.2.4 监测试验马临床症状  42-43
    3.2.5 定期采集试验马血液样品  43
    3.2.6 建立realtime PCR标准曲线  43-44
    3.2.7 建立realtime RT-PCR标准曲线  44-45
    3.2.8 测定EIAV前病毒DNA载量  45-46
    3.2.9 测定EIAV病毒RNA载量  46
    3.2.10 血清抗体检测  46-47
    3.2.11 测定EIAV前病毒gp90和LTR序列  47-50
    3.2.12 EIAV gp90和LTR的序列分析  50
    3.2.13 pLTR/CAT系列质粒的构建  50-53
    3.2.14 LTR启动子活性研究  53-55
第4章结果与分析  55-100
  4.1 EIAV的免疫与攻毒  55-57
    4.1.1 免疫和攻毒期间的临床观察  55-57
  4.2 免疫和攻毒期间的病毒复制特性研究  57-66
    4.2.1 Realtime PCR标准曲线的建立  57-58
    4.2.2 免疫期和攻毒期试验马PBMC前病毒DNA载量的变化  58-62
    4.2.3 Realtime RT-PCR标准曲线的建立  62
    4.2.4 免疫期和攻毒期试验马血浆病毒RNA载量的变化  62-66
  4.3 免疫和攻毒期间试验马的体液免疫反应  66-71
    4.3.1 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV gp45抗原的抗体变化  66-67
    4.3.2 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p26抗原的抗体变化  67-68
    4.3.3 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p15抗原的抗体变化  68-69
    4.3.4 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p11抗原的抗体变化  69-70
    4.3.5 免疫期和攻毒期试验马血清抗EIAV p9抗原的抗体变化  70-71
  4.4 免疫期和攻毒期EIAV gp90的进化分析  71-86
    4.4.1 PBMC前病毒gp90的扩增与克隆  71-72
    4.4.2 免疫期试验马体内gp90的变异分析  72-76
    4.4.3 攻毒期试验马体内gp90的变异分析  76-80
    4.4.4 攻毒期gp90种群的演化分析  80-82
    4.4.5 攻毒后不同时期gp90nt和aa的变异规律  82-84
    4.4.6 分析攻毒期间机体对病毒gp90的选择作用  84-86
  4.5 体内和体外感染过程中EIAV LTR的变异趋势  86-97
    4.5.1 体内或体外感染EIAV的细胞中前病毒LTR的扩增与克隆  86-87
    4.5.2 体内传代导致的EIAV LTR的序列变异  87-88
    4.5.3 体外传代导致的EIAV LTR的序列变异  88-90
    4.5.4 分析EIAV-L与其体内和体外衍生毒株之间的LTR进化关系  90-92
    4.5.5 EIAV-DLA LTR在动物体内感染过程中的种群纯化趋势  92-93
    4.5.6 攻毒前后未发病马PBMC前病毒LTR的序列分析  93-95
    4.5.7 攻毒后发病马PBMC前病毒LTR的序列分析  95-97
  4.6 LTR启动子活性的研究  97-100
    4.6.1 EIAV LTR启动CAT表达的质粒的构建  97-98
    4.6.2 不同LTR启动子在eMDM上启动活性的比较研究  98-100
第5章讨论与结论  100-110
  5.1 讨论  100-108
    5.1.1 EIAV的复制动力学  100-102
    5.1.2 EIAV LTR的序列与启动子活性研究  102-104
    5.1.3 EIAV感染中病毒gp90的变异趋势  104-106
    5.1.4 感染EIAV后的机体反应  106-108
  5.2 结论  108-110
参考文献  110-121
致谢  121-122
附录  122

马传染性贫血病病毒的基因变异与生物学特性研究

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