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卵丘细胞对猪卵母细胞成熟及其发育能力的影响

作　者: 郝元斌
导　师: 芮荣
学　校: 南京农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 猪卵丘细胞卵母细胞体外成熟发育 Fas/FasL
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

随着胚胎生物技术的发展,对体外成熟卵母细胞的质量要求日益增加。卵母细胞体外成熟及其发育能力的研究已成为体外受精(IVF)、胚胎体外生产(IVP)和体细胞核移植(SCNT)等技术发展的关键之一。目前,通过体外培养而获得的卵母细胞,其胞质成熟程度仍不及体内成熟卵母细胞,深入了解卵母细胞的成熟规律,进一步改善体外培养技术,不断完善卵母细胞的体外成熟培养系统依然是当前胚胎生物技术领域的重要内容之一。业已证明,卵丘细胞在卵母细胞成熟过程中扮演着重要角色。研究卵丘细胞对卵母细胞成熟及其发育能力的影响,具有重要的理论意义和实用价值。本实验拟通过对猪裸卵单独培养、裸卵与卵丘细胞共培养及卵丘-卵母细胞复合体(COC)与卵泡的培养与比较,侧重研究卵丘细胞对猪卵母细胞发育成熟的作用,卵丘细胞对体外受精(IVF)胚胎发育的影响。采用Real-time PCR测定各组猪卵母细胞Fas/FasL mRNA相对表达量,分析卵母细胞体外成熟、受精及其后的胚胎发育过程中Fas/FasL mRNA表达水平的变化,为进一步了解卵丘细胞影响猪卵母细胞体外成熟及发育能力的分子机理提供实验参考。试验结果表明：(1)裸卵组、裸卵与卵丘细胞共培养组及COC组卵母细胞,经体外成熟培养48h后,透明带外径均显著高于培养前对照组(分别为158.41±5.82、160.02±4.05、160.38±5.98对148.96±5.30；P<0.05),但3组间培养后的透明带外径差异不显著(p>0.05)。(2)COC组猪卵母细胞经成熟培养后第一极体(pbI)排出率最高(71.25%),显著高于共培养组、裸卵组和卵泡组(分别为49.32%,31.46%和27.14%；P<0.05)；共培养组pbI排出率显著高于裸卵组和卵泡组,以卵泡组的pbI排出率最低。COC组所获A级卵母细胞的比例也显著高于其他3组,共培养组则高于裸卵组和卵泡组。COC组C级卵母细胞比例最低(8.33%),卵泡组C级卵母细胞比例18.57%,共培养组为24.43%,裸卵组所获C级卵母细胞比例最高,达44.60%。COC组卵母细胞存活率为90.83%,显著高于其他各组；裸卵组最低,为53.33%。结果显示,卵丘细胞对猪卵母细胞的成熟及质量均具有显著的影响。卵母细胞的成熟,可能受卵丘细胞的旁分泌作用与细胞间缝隙连接的双重调控。(3)卵泡组的pbⅠ排出率虽然较低,但它的卵母细胞存活率显著高于裸卵组,且卵泡组以B级卵母细胞居多,pbⅠ排出率低可能与卵母细胞的核成熟有关,卵泡整体培养有可能存在抑制卵母细胞核成熟的因素,导致pbⅠ排出率降低,但大量B级卵母细胞的产生,至少可以说明卵泡结构对于卵母细胞具有积极的保护作用。(4)COC组在2-细胞、4-细胞期和囊胚期的发育率与存活率,均显著高于裸卵与卵丘细胞共培养组或裸卵组。而裸卵与卵丘细胞共培养,其各期胚胎发育率和存活率又高于裸卵单独培养,不过此两组间无统计学差异。表明卵丘细胞与卵母细胞间的缝隙连接,对猪卵母细胞的发育能力具有明显的影响。(5)卵母细胞从GV期到MⅡ期,其Fas/FasL mRNA表达量并无显著增加,Fas/FasL mRNA在此阶段的表达一直处于较低水平。与GV期相比,COC组、裸卵与卵丘细胞共培养组、裸卵组和卵泡组MⅡ期卵母细胞Fas/FasL mRNA表达量各组均有所升高,但各组间无显著差异。在卵母细胞成熟阶段,Fas/FasL凋亡信号通路也许并非主要的调控方式,这是否暗示该阶段卵母细胞的凋亡调控还可能存在其他信号通路,尚需进一步的研究。(6)胚胎早期各阶段均有Fas/FasL mRNA的表达,在胚胎2-细胞阶段,裸卵组胚胎Fas/FasL mRNA表达量迅速提高,显著高于裸卵与卵丘细胞共培养组胚胎Fas/FasL mRNA表达量,裸卵与卵丘细胞共培养组胚胎Fas/FasL mRNA表达量又显著高于COC组胚胎Fas/FasL mRNA表达量。在胚胎4细胞阶段,裸卵与卵丘细胞共培养组胚胎的Fas/FasL mRNA表达量要显著高于COC组胚胎Fas/FasL mRNA表达量(P<0.05)。表明卵母细胞成熟培养过程中,卵丘细胞具有显著抑制IVF胚胎Fas/FasL mRNA表达的作用。

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摘要 6-8ABSTRACT 8-11简写及缩略语 11-12第一部分文献综述 12-36 第一章卵丘细胞在卵母细胞发育与成熟中的作用 12-28 1 卵母细胞发育与成熟 12-16 1.1 卵母细胞发育成熟的一般规律 12-13 1.2 卵母细胞成熟的特征 13-15 1.3 卵母细胞的成熟鉴定 15 1.4 卵母细胞的核成熟与胞质成熟 15-16 2 颗粒细胞及卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用 16-23 2.1 卵母细胞对卵丘细胞及颗粒细胞的影响 17-18 2.2 卵丘细胞在卵母细胞成熟发育中的作用 18-21 2.3 卵丘细胞与卵母细胞的旁分泌与缝隙连接作用 21 2.4 卵母细胞体外成熟共培养体系的研究 21-23 3 Fas/FasL系统在卵母细胞与胚胎发育过程中的作用 23-25 3.1 Fas/FasL系统 23-24 3.2 Fas/FasL mRNA在卵母细胞的表达及相应蛋白质的分布 24 3.3 Fas/FasL与颗粒细胞凋亡 24-25 4 卵母细胞凋亡 25-28 4.1 卵母细胞凋亡的分子机理 25 4.2 卵母细胞凋亡高发阶段 25-28 参考文献 28-36第二部分试验研究 36-72 第二章卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟、受精及胚胎发育的影响 36-55 1 材料 36-40 1.1 主要仪器设备 36-37 1.2 主要试剂和药品 37-38 1.3 各种试剂、激素的准备 38-40 2 方法 40-46 2.1 猪卵巢卵母细胞采集 40 2.2 卵丘细胞共培养饲养层的制备 40 2.3 猪卵母细胞体外成熟培养 40-42 2.4 卵母细胞成熟与胚胎质量鉴定 42-43 2.5 卵母细胞直径的测量 43 2.6 猪卵母细胞体外受精与胚胎培养 43-44 2.7 试验设计 44-46 2.8 数据统计分析 46 3 结果 46-51 3.1 卵丘细胞对卵母细胞生长的影响 46-47 3.2 卵丘细胞对猪卵母细胞成熟的影响 47-48 3.3 卵丘细胞对卵母细胞成熟质量的影响 48-49 3.4 卵丘细胞对卵母细胞存活率的影响 49 3.5 卵丘细胞对IVF胚胎发育的影响 49-50 3.6 卵丘细胞对IVF胚胎存活率的影响 50-51 4 讨论 51-53 4.1 卵母细胞生长及其直径的变化 51 4.2 卵丘细胞在卵母细胞成熟过程中的作用 51-52 4.3 卵丘细胞对体外受精胚胎发育的影响 52-53 参考文献 53-55 第三章猪卵母细胞体外成熟、受精与胚胎发育过程中Fas/FasL mRNA表达水平的变化 55-72 1 材料 55-58 1.1 主要仪器设备 55-56 1.2 主要试剂和药品名称 56-57 1.3 主要试剂的配制 57 1.4 试验材料 57-58 2 方法 58-62 2.1 总RNA提取与鉴定 58-59 2.2 反转录cDNA 59-60 2.3 Real-time PCR 60-61 2.4 试验设计 61-62 2.5 数据统计与分析 62 3 结果 62-67 3.1 卵丘细胞对猪卵母细胞成熟过程中Fas/FasL mRNA表达的影响 62-64 3.2 卵丘细胞对猪IVF胚胎发育过程中Fas/FasL mRNA表达的影响 64-67 4 讨论 67-70 4.1 猪卵母细胞成熟过程中Fas/FasL mRNA的表达 67 4.2 猪IVF胚胎发育过程中Fas/FasL mRNA的表达 67-70 参考文献 70-72全文总结 72-73附录一常用溶液的配制 73-75附录二图版及说明 75-76致谢 76

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