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哈维氏弧菌外膜蛋白（OmpK和GAPDH）免疫原性研究及主要海水病原弧菌外膜蛋白交叉保护性抗原筛选

作　者: 张崇文
导　师: 于涟
学　校: 浙江大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 哈维氏弧菌副溶血弧菌溶藻弧菌外膜蛋白 OmpK 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 大黄鱼免疫蛋白质组学亚单位疫苗
分类号: S941
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

海洋弧菌是海水环境中普遍存在的一种革兰氏阴性细菌，其中某些种类是大黄鱼等海水养殖动物细菌性溃疡病的主要病原菌。鉴于滥用抗生素所造成的药物残留、细菌耐药性等不良后果，大黄鱼弧菌病的防治不得不从以化学药物治疗为主转向免疫预防。近年来，革兰氏阴性细菌外膜蛋白作为潜在的保护性抗原已越来越引起人们的重视。本研究从患病大黄鱼上分离得到三种常见病原菌：哈维氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌，以哈维氏弧菌为主，克隆并表达了两个外膜蛋白基因，研究了它们作为亚单位疫苗的免疫原性。利用免疫蛋白质组学方法结合基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术，鉴定了三种弧菌具有交叉免疫反应性的外膜蛋白成分，探索开发基因工程多价疫苗的可能性。哈维氏弧菌ompK基因含有一个804bp的开放读码框（ORF），编码由267个氨基酸组成的外膜蛋白OmpK，预测的分子量约为29KDa，pI为6.764。序列测定结果用BLAST软件搜索比对，和已登录的哈维氏弧菌外膜蛋白基因ompK的同源性高达99％，该基因在GenBank登录号为DQ279075；哈维氏弧菌gapdh基因含有一个996bp的开放读码框（ORF），编码由331个氨基酸组成的三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH，预测的分子量约为35KDa，pI为5.187。BLAST软件搜索比对发现多种不同弧菌的gapdh是高度保守的，它们的核苷酸同源性在91％以上。该基因在GenBank登录号为DQ184650。用LipoP软件分析可知ompK基因N端存在一个由20个氨基酸组成的信号肽，但gapdh基因没有发现信号肽序列，其到达细胞外膜的机制尚不明确。将ompK基因的信号肽序列去除经重叠延伸基因拼接扩增（SOE-PCR）和gapdh基因融合成ompK-gapdh,分别构建原核表达载体pET-30a-ompK，pET-30a-gapdh和pET-30a-ompK-gapdh，在E.coliBL21中成功大量表达。重组OmpK和GAPDH经Ni-NTA亲和层析柱纯化后免疫新西兰兔，产生的多克隆抗体不仅能够分别跟各自的免疫原发生免疫反应，而且能够和提取的天然外膜蛋白产生免疫印迹，表明重组蛋白和天然外膜蛋白具有相似的免疫原性。新鲜培养的哈维氏弧菌能够分别被兔抗r-OmpK和兔抗r-GAPDH抗血清凝集，证明OmpK和GAPDH位于细胞表面。根据同源建模原理模拟了哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK、GAPDH的三维结构。外膜蛋白OmpK是由12个反向平行的β折叠经6个表面环和5个外周回折连成的桶状结构，以单体形式穿过细胞外膜形成通道；三磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH只是两个结构域经一短链连接而成，每个结构域各包含9个反向平行的β折叠和6个α螺旋。提取自哈维氏弧菌的天然外膜蛋白沸水浴中加热一段时间后经SDS-PAGE，分别和兔抗r-OmpK和兔抗r-GAPDH抗血清反应。由于加热使得孔蛋白的构像发生改变，包括β桶状二级结构的丧失等，兔抗r-OmpK血清反应中出现了两条反应带，表明OmpK类似于OmpA家族，具有热修饰性。而兔抗r-GAPDH血清只出现一条带，说明GAPDH无热修饰性。将r-OmpK-GAPDH，r-OmpK，r-GAPDH及二者的混合物分别免疫大黄鱼，采集血清，ELISA检测抗体效价，尽管免疫组和对照组差别显著（p＜0.05），但抗体效价不是很高，表明体液免疫在外膜蛋白引起的抗病过程中作用有限。分离试验大黄鱼的巨噬细胞，测定其对啤酒酵母的吞噬百分率和吞噬指数。统计结果表明巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数不仅免疫组和对照组差别显著（p＜0.05），免疫组内r-OmpK-GAPDH和其他各组的差异也很明显（p＜0.05），意味着细胞免疫在外膜蛋白的免疫保护中具有重要作用。各试验组大黄鱼用500×LD₅₀的哈维氏弧菌感染，各免疫组的相对成活率r-OmpK（37.7％），r-GAPDH（40.0％）及二者的混合物（41.9％），r-OmpK-GAPDH（69.1％）都显著高于对照组，其中r-OmpK-GAPDH（69.1％）最高，说明OmpK和GAPDH具有一定的免疫原性，二者融合后显示出明显的协同作用，可以作为亚单位疫苗的候选成分。从患病大黄鱼中分离的8株病菌，经常规生理生化方法和以HSP60基因部分序列为基础的分子生物学方法鉴定为三种病原弧菌：哈维氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌。SDS-PAGE和Western-blots结果显示三种弧菌的外膜蛋白和哈维氏弧菌全菌多抗反应分别在45kDa，35kDa和22 kDa处出现三条大致相同的免疫条带，提示它们有可能是三种弧菌的交叉保护性抗原。利用免疫蛋白质组学方法结合基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术，鉴定出哈维氏弧菌与副溶血弧菌和溶藻弧菌具有交叉反应性的部分外膜蛋白分别是副溶血弧菌麦芽糖孔蛋白和溶藻弧菌的一种功能未知的孔蛋白。以这些蛋白为目标抗原制备基因工程疫苗，可望能够同时抵抗不同种弧菌的感染，在基因工程多价疫苗的开发方面具有重要意义。

全文目录

摘要  13-15
Abstract  15-18
第一部分文献综述  18-47
  一、鱼类的免疫系统和免疫机制  19-23
    1.鱼类的特异性免疫系统  19
      1.1 鱼类特异性体液免疫  19
      1.2 鱼类特异性细胞免疫  19
    2.鱼类的非特异性免疫系统  19-20
      2.1 鱼类非特异性体液免疫  19-20
      2.2 鱼类非特异性细胞免疫  20
    3.鱼类免疫应答的基本过程  20-23
  二、鱼类病害的免疫预防——历史及现状  23-27
    (一) 鱼类疫苗的种类  23-26
      1.传统疫苗  23-24
        1.1 灭活疫苗  23-24
        1.2 减毒疫苗  24
        1.3 亚单位疫苗  24
      2.基因工程疫苗  24-26
        2.1 基因工程亚单位疫苗  24
        2.2 基因工程减毒活疫苗  24-25
        2.3 基因工程活载体疫苗  25
        2.4 DNA疫苗  25-26
    (二) 鱼用疫苗研究现状  26-27
  三、病原体的保护性抗原及其筛选方法  27-37
    (一) 革兰氏阴性菌外膜蛋白的结构与生物学功能  27-36
      1.外膜蛋白的组成、结构及功能  28-31
        1.1 OmpA蛋白  28-29
        1.2 微孔蛋白  29-31
        1.3 脂蛋白  31
        1.4 微量蛋白  31
      2、Omp的致病作用  31-32
      3.受体功能  32-33
      4.Omp的免疫保护作用  33-35
      5、Omp与LPS相互作用  35
      6、外膜蛋白应用前景展望  35-36
    (二) 抗原性基因筛选方法  36-37
      1.表达文库免疫技术  36
      2.噬菌体表面展示技术  36
      3.反向疫苗学  36-37
      4.免疫蛋白质组学  37
  四、蛋白质质谱分析研究进展  37-40
    1.质谱分析的特点  37
    2.质谱分析的方法  37-38
    3.蛋白质的质谱分析  38-40
      3.1 蛋白质的质谱分析原理  38
      3.2 蛋白质和肽的序列分析  38-39
      3.3 蛋白质的质谱分析方式  39-40
        3.3.1 蛋白消化  39
        3.3.2 基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOF MS)  39-40
        3.3.3 电子喷雾电离质谱测量法  40
  五、鱼类免疫学及疫苗学的发展趋势  40-41
  参考文献  41-47
第二部分研究内容  47-127
  第一章概述  48-56
    1.1 研究的背景及意义  48-50
    1.2 主要研究内容  50-51
    1.3 研究技术路线  51-52
    参考文献  52-56
  第二章哈维氏弧菌外膜蛋白ompK基因和3-磷酸甘油醛脱氢酶gapdh基因的克隆  56-72
    2.1 引言  56-57
    2.2 材料  57
    2.3 方法  57-62
      2.3.1 哈维氏弧菌总DNA的提取  57
      2.3.2 引物设计  57-58
        2.3.2.1 ompK基因引物  57
        2.3.2.2 gapdh基因引物  57-58
      2.3.3 基因扩增  58-59
        2.3.3.1 ompK基因扩增  58
        2.3.3.2 gapdh基因扩增  58-59
      2.3.4 PCR产物的纯化  59
      2.3.5 感受态细胞的制备  59-60
      2.3.6 T载体与PCR产物的连接  60
      2.3.7 转化及蓝白斑筛选阳性克隆  60
      2.3.8 碱裂解法小量制备重组质粒  60-61
      2.3.9 重组质粒的鉴定  61-62
        (1) 重组质粒的酶切鉴定  61
        (2) 重组质粒的PCR鉴定  61-62
        (3) 重组质粒的测序鉴定  62
      2.3.10 信号序列预测  62
    2.4 结果  62-66
      2.4.1 ompK和gapdh基因的克隆结果  62
      2.4.2 pGEM-T-ompK和pGEM-T-gapdh的酶切鉴定结果  62-63
      2.4.3 pGEM-T-ompK和pGEM-T-gapdh的PCR鉴定结果  63-64
      2.4.4 pGEM-T-ompK和pGEM-T-gapdh的测序鉴定  64
      2.4.5 信号肽分析结果  64-65
      2.4.6 pGEM-T-gapdh的测序鉴定  65-66
    2.5 结果分析与讨论  66-67
    参考文献  67-72
  第三章 ompK和gapdh及其融合基因ompK-gapdh原核表达载体的构建与表达  72-87
    3.1 引言  72
    3.2 材料  72
      3.2.1 质粒和菌株  72
      3.2.2 主要试剂  72
      3.2.3 主要仪器  72
    3.3 方法  72-79
      3.3.1 引物设计  72-73
      3.3.2 原核表达载体的构建  73-77
        3.3.2.1 缺失信号肽序列的ompK基因片段的克隆  73
        3.3.2.2 gapdh基因(携带双酶切位点)的克隆  73-74
        3.3.2.3 重叠延伸基因拼接(SOEing)扩增融合基因  74-77
          1) 重叠延伸基因拼接扩增(SOEing)机制  74-75
          2) 融合片段ompK的克隆  75
          3) 融合片段gapdh的克隆  75-76
          4) 基因融合  76-77
        3.3.2.4.PCR产物的纯化  77
        3.3.2.5 碱裂解法小量制备载体质粒pET-30a(+)  77
        3.3.2.6 载体质粒、PCR产物的双酶切  77
        3.3.2.7 载体片段与PCR产物的连接  77
        3.3.2.8 转化及蓝白斑筛选阳性克隆  77
      3.3.4 重组蛋白表达条件的优化  77-78
        1) 表达条件的优化  77-78
        2) SDS-PAGE  78
      3.3.5 重组蛋白的纯化  78-79
        1) 表达方式检测  78
        2) 纯化  78-79
      3.3.6 三维结构模拟  79
    3.4 结果  79-85
      3.4.1 表达基因片段的克隆  79
      3.4.2 重组质粒双酶切鉴定结果  79-80
      3.4.3 重组质粒测序鉴定结果  80-82
      3.4.4 最佳表达温度  82
      3.4.5 最佳诱导时间  82
      3.4.6 最佳诱导浓度  82-83
      3.4.7 重组蛋白的表达方式检测  83
      3.4.8 重组蛋白的纯化  83-84
      3.4.9 三维结构预测  84-85
    3.5 结果分析与讨论  85-86
    参考文献  86-87
  第四章重组蛋白多克隆抗体的制备及免疫印迹反应  87-96
    4.1 引言  87
    4.2 材料  87
    4.3 方法  87-91
      4.3.1 多克隆抗体制备及其效价测定  87-89
        1) 动物免疫  87
        2) ELISA检测血清抗体效价  87-88
        3) 血清凝集实验  88-89
      4.3.2 哈维氏弧菌外膜蛋白的提取  89-90
        1) SDS法  89
        2) Sarkosyl法  89-90
      4.3.3 哈维氏弧菌外膜蛋白热可变性研究  90
        1) SDS-PAGE  90
        2) Western-blotting  90
      4.3.4 重组外膜蛋白OmpK、GAPDH和OmpK-GAPDH免疫反应性检测  90-91
        1) 兔抗OmpK血清和兔抗GAPDH血清的稀释和吸附  90-91
        2) SDS-PAGE和电转印  91
        3) Western-blotting  91
    4.4 结果  91-94
      4.4.1 兔抗r-OmpK,兔抗r-GAPDH多克隆抗体效价测定  91-92
        1) ELISA检测抗体效价  91-92
        2) 血清凝集实验结果  92
      4.4.2 哈维氏弧菌外膜蛋白热可变性  92-93
      4.4.3 重组外膜蛋白OmpK、GAPDH和OmpK-GAPDH免疫反应性  93-94
    4.5 结果分析与讨论  94-95
    参考文献  95-96
  第五章 r-OMPK和r-GAPDH及r-OMPK-GAPDH免疫原性检测  96-106
    5.1 引言  96
    5.2 试剂和材料  96
    5.3 方法  96-99
      5.3.1 大黄鱼  96
      5.3.2 免疫  96
      5.3.3 采样  96-97
      5.3.4 巨噬细胞分离  97
      5.3.5 细胞记数和活性测定  97
      5.3.6 吞噬活性检测  97-98
      5.3.7 ELISA检测抗体效价  98
      5.3.8 感染实验  98-99
        1) 感染菌株的准备  98-99
        2) 人工感染  99
    5.4 结果  99-101
    5.5 结果分析与讨论  101-102
    参考文献  102-106
  第六章几种弧菌病原株的分子生物学鉴定及其外膜蛋白免疫印迹  106-115
    6.1 引言  106
    6.2 菌株、试剂和仪器  106-107
    6.3 方法  107-109
      6.3.1 病原菌的分离  107
      6.3.2 病原菌的生化鉴定  107
      6.3.3 病原菌的分子生物学鉴定  107-108
        6.3.3.1 病菌DNA抽提  107
        6.3.3.2 引物设计  107
        6.3.3.3 HSP60基因部分序列扩增  107-108
        6.3.3.4 系统进化树分析  108
      6.3.4 哈维氏弧菌全菌多抗制备  108
        6.3.4.1 哈维氏弧菌灭活  108
        6.3.4.2 抗血清制备和效价检测  108
      6.3.5 哈维氏弧菌外膜蛋白的提取  108
      6.3.6 凝胶电泳和免疫印迹  108-109
    6.4 结果  109-113
      6.4.1 病原菌分离和常规鉴定  109-110
      6.4.2 HSP60基因部分序列扩增  110
      6.4.3 系统进化树分析  110-111
      6.4.4 哈维氏弧菌的灭活结果  111-112
      6.4.5 抗血清效价检测  112
      6.4.6 凝胶电泳和免疫印迹  112-113
    6.5 结果分析与讨论  113-114
    参考文献  114-115
  第七章三种典型致病弧菌交叉保护性抗原鉴定  115-127
    7.1 引言  115
    7.2 仪器和试剂  115-116
    7.3 方法  116-120
      7.3.1 Sarcosyl法抽提外膜蛋白  116
      7.3.2 样品处理  116
      7.3.3 Bradford法定量  116
      7.3.4 IPGIEF  116-117
      7.3.5 垂直电泳  117-118
      7.3.6 Western-blotting  118-119
      7.3.7 胶内胰酶消化  119
      7.3.8 质谱分析  119-120
      7.3.9 数据搜索  120
    7.4 结果  120-123
      7.4.1 双向电泳及免疫印迹结果  120-121
      7.4.2 质谱分析结果  121-122
      7.4.3 搜索数据库结果  122-123
    7.5 结果分析与讨论  123-125
    参考文献  125-127
第三部分总结与展望  127-130
  3.1.结论及主要创新点  128-129
  3.2.不足与展望  129-130
第四部分附录  130-140
  附录1 常用试剂及配制  131-137
  附录2 攻读博士期间发表或录用的学术论文  137-138
  附录3 GeneBank登录序列一览  138-140
致谢  140-141

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