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大黄鱼PPARβ基因的cDNA克隆和组织表达

作　者: 钱伦
导　师: 钱云霞
学　校: 宁波大学
专　业: 水产养殖
关键词: 大黄鱼香鱼 PPARβ 克隆组织表达
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

PPAR(peroxisome proliferator-activated receptor),即过氧化物酶体增殖剂激活受体,是一类由配体激活的核转录因子,为核受体家族的一员。PPAR在调节脂类代谢及机体能量代谢平衡方面有重要作用。在哺乳动物中发现PPAR存在三种亚型,即PPARα、PPARβ(也称PPARδ)和PPARγ。目前对PPARα和PPARγ已进行了较多研究,但有关PPARβ的研究报道较少。本文通过克隆大黄鱼、香鱼两种鱼类PPARβ基因cDNA序列,分析PPARβ及其亚型的结构特性,初步探讨了该基因在鱼类中的功能和作用机制。利用RT-PCR和SMART RACE的方法从大黄鱼肝脏中克隆了PPARβ全长cDNA。该序列全长3408bp,5’端非翻译区146bp,3’端非翻译区1729bp,开放阅读框1533bp,可编码一个由510个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白质理论分子量为57.2kDa、等电点为6.46。氨基酸序列分析表明,PPARβ基因具有较高的保守性,大黄鱼PPARβ与金头鲷(Sparus aurata)、牙鲷(Dentex dentex)、军曹鱼(Rachycentron canadum)、舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)、花鲈(Lateolabrax japonicus)、欧鲽(Pleuronectes platessa)、大西洋鲑(Salmo salar)、红旗东方鲀(Takifugu rubripes)、斑马鱼(Danio rerio)、原鸡(Gallus gallus)、短尾负鼠(Monodelphis domestica)、人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、牛(Bos taurus)、兔(Oryctolagus cuniculus)、野猪(Sus scrofa)、小鼠(Mus musculus)、爪蟾(Xenopus laevis)等十八个物种的同源性为68%~92%,其中与金头鲷、牙鲷、军曹鱼及舌齿鲈同源性最高,为92%。用RT-PCR法检测PPARβ基因的组织表达,结果表明该基因在大黄鱼肌肉、眼、脾、肾、肝、鳃、心、肠和脑等九个组织中均有表达,其中肝脏组织表达量最大,肌肉最少。通过RT-PCR反应,成功克隆了219bp的香鱼PPARβ部分cDNA序列。通过5’SMART RACE实验扩增到两个PPARβ亚型的5’端片段,而在3’SMART RACE实验中也扩增到了两个含有完整polyA结构的不同3’端序列。通过比对分析,确定香鱼至少存在两种亚型的PPARβ,但未能成功克隆它们的全长cDNA。通过对三种假定的香鱼PPARβ及其他物种PPARβ氨基酸序列的分析,发现在其四个功能结构域中DNA结合区(DBD)最为保守,配体结合区(LBD)次之,N端A/B区保守性最低。PPARβ及其亚型的同源性分析表明,假定的香鱼PPARβ、大黄鱼PPARβ、花鲈PPARβ与斑马鱼PPARβ2、大西洋鲑PPARβ2A、PPARβ2B为同一亚型,而斑马鱼PPARβ1、大西洋鲑PPARβ1A、PPARβ1B同属另一亚型。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
引言  11-13
1 综述  13-21
  1.1 PPAR 的分型和组织分布  13-14
  1.2 PPAR 的配体和作用机制  14-15
  1.3 PPAR 在脊椎动物发育中的作用  15-17
  1.4 PPAR 与脂代谢  17-18
  1.5 PPAR 和过氧化物酶体作为生物标记物  18-19
  1.6 PPAR 在鱼类中的研究进展  19-21
2 大黄鱼 PPARβ基因全长cDNA 的克隆和组织表达  21-43
  2.1 实验材料和仪器  21-22
    2.1.1 实验材料  21
    2.1.2 实验中所用试剂盒  21
    2.1.3 其他主要试剂  21-22
    2.1.4 主要仪器  22
  2.2 实验方法  22-32
    2.2.1 RNA 的提取  22-23
    2.2.2 肝脏常规cDNA 的合成  23
    2.2.3 大黄鱼PPARβ核心片段的获取  23-24
    2.2.4 PCR 产物的纯化  24
    2.2.5 重组质粒的构建和检测  24-27
    2.2.6 3’Ready cDNA 的合成  27
    2.2.7 3’SMART RACE PCR 扩增  27-29
    2.2.8 5’Ready cDNA 的合成  29
    2.2.9 5’SMART RACE PCR 扩增  29-30
    2.2.10 大黄鱼PPARβ的组织表达  30-32
  2.3 实验结果和分析  32-41
    2.3.1 大黄鱼PPARβ基因的序列分析  32-39
    2.3.2 大黄鱼PPARβ基因的组织表达  39-41
  2.4 讨论  41-43
3 香鱼 PPARβ cDNA 序列的克隆  43-55
  3.1 实验材料和仪器  43
  3.2 实验方法  43
  3.3 结果与分析  43-53
  3.4 讨论  53-55
4 总结和展望  55-56
参考文献  56-62
缩略词  62-63
在学研究成果  63-64
致谢  64

大黄鱼PPARβ基因的cDNA克隆和组织表达

内容摘要

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