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溶藻弧菌诱导红笛鲷仔鱼差减文库的构建及其表达序列标签分析

作　者: 尚晓飞
导　师: 鲁义善
学　校: 广东海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 溶藻弧菌 抑制性差减杂交(SSH) 表达序列标签(EST) 红笛鲷
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


本论文以灭活溶藻弧菌诱导的红笛鲷仔鱼为研究对象,选择仔鱼母源抗体完全降解,而其自身免疫尚未完全建立这段“特异性免疫应答无能期”,通过抑制消减杂交技术(SSH),构建了诱导组和对照组的cDNA差减文库,并对与红笛鲷仔鱼抗菌免疫和免疫系统成熟相关功能基因的表达序列标签(ESTs)进行了分析。本研究以灭活溶藻弧菌(1.0×10~8 cfu/mL)浸泡的红笛鲷仔鱼cDNA为tester,以PBS浸泡的红笛鲷仔鱼cDNA为driver,利用抑制性差减杂交技术构建cDNA差减文库。经检测文库容量为2×10~6个克隆,蓝白斑检验表明重组率为90%,PCR检测表明目的片段大多分布在0.3~1.0 kb之间,符合建库要求。通过对1000个随机筛选的克隆进行测序,共获得ESTs 910个。BLASTx同源性分析表明:720个ESTs序列与NCBI非冗余蛋白质数据库中的蛋白质序列存在显著的相似性,140个ESTs序列与NCBI非冗余蛋白质数据库中的蛋白质序列存在一定相似性,50个ESTs序列与数据库中的蛋白质序列没有相似性。将BLASTx同源性分析结果进行GO分类可将获得的ESTs分为以下8类:免疫防御应激类(7个ESTs,占1%)、细胞骨架类(34个ESTs,占4%)、核糖体类(258个ESTs,占29%)、细胞代谢/呼吸链类(430个ESTs,占51%)、细胞信号转导/粘附类(43个ESTs,占5%)、细胞周期/DNA复制/蛋白调控/转录/翻译类(25个ESTs,占3%)、转运类(17个ESTs,占2%)、其他类(43个ESTs,占5%)。本论文的研究结果为探讨红笛鲷仔鱼免疫防御相关功能基因的作用机理和调控机制奠定了坚实的基础,丰富和发展了仔鱼分子免疫学的研究内容,对于全面了解和认识红笛鲷仔鱼免疫防御的分子机制,具有重要的理论指导意义。

全文目录


摘要  6-7ABSTRACT  7-111 文献综述  11-18  1.1 仔鱼的免疫防御  11  1.2 基因文库  11-12  1.3 cDNA 文库构建策略  12-13    1.3.1 经典cDNA 文库  12    1.3.2 cDNA 全长文库  12    1.3.3 均一化cDNA 文库  12-13    1.3.4 cDNA 差减文库  13  1.4 差异基因的高通量筛选  13-17    1.4.1 差异显示反转录PCR  13    1.4.2 抑制消减杂交  13-14    1.4.3 基因表达系列分析  14    1.4.4 微阵列技术  14    1.4.5 代表性差异分析法  14    1.4.6 杂交监控差异分析法  14    1.4.7 抑制性消减杂交(SSH)技术的基本原理  14-15    1.4.8 进行抑制性消减杂交的技术要点  15-17  1.5 研究背景、进展、目的及意义  17-182 材料与实验方法  18-28  2.1 红笛鲷的孵化  18  2.2 溶藻弧菌培养  18  2.3 样品的处理  18  2.4 总RNA 提取及mRNA 纯化  18-20    2.4.1 总RNA 的提取  18-19    2.4.2 mRNA 的纯化  19-20  2.5 SSH 差减文库的构建  20-25    2.5.1 cDNA 第一链的合成  20    2.5.2 cDNA 第二链的合成  20-21    2.5.3 Rsa Ⅰ酶切  21    2.5.4 接头连接  21-22    2.5.5 接头连接效率检测  22-23    2.5.6 一次杂交  23    2.5.7 二次杂交  23    2.5.8 两轮PCR 扩增  23-24    2.5.9 差减效率的检测  24-25  2.6 PCR 产物的分子克隆  25-26    2.6.1 PCR 产物的纯化  25    2.6.2 感受态细胞的制备  25    2.6.3 PCR 产物与载体的连接  25    2.6.4 转化  25-26    2.6.5 阳性克隆的PCR 鉴定  26  2.7 测序  26  2.8 文库质量评价  26-27  2.9 生物信息学分析  27-283 实验结果  28-36  3.1 总 RNA 质量鉴定  28  3.2 mRNA 的纯化  28-29  3.3 双链 cDNA 的合成及 RsaⅠ 酶切  29  3.4 接头连接效率的检测  29-30  3.5 差减杂交PCR 产物分析  30  3.6 差减效率的检测  30-31  3.7 阳性克隆的PCR 鉴定  31-32  3.8 文库质量评价  32  3.9 ESTs 生物信息学分析及功能分类  32-33  3.10 差减文库中分离得到的ESTs  33-364 讨论  36-42  4.1 抑制性消减杂交技术(SSH)  36-37  4.2 文库质量检测  37  4.3 测序结果讨论  37-42    4.3.1 免疫防御应激蛋白  38    4.3.2 细胞骨架相关蛋白  38-39    4.3.3 核糖体相关蛋白  39    4.3.4 能量和基础代谢相关蛋白  39    4.3.5 细胞信号转导/粘附相关蛋白  39-40    4.3.6 细胞周期/DNA 复制/蛋白调控/转录/翻译相关蛋白  40    4.3.7 其他类蛋白  40-425 结论  42-43参考文献  43-48致谢  48-49作者简介  49-50导师简介  50

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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