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用于溶藻弧菌快速检测的免疫磁珠技术的研究

作　者: 纪勇
导　师: 鄢庆枇
学　校: 集美大学
专　业: 水产养殖
关键词: 溶藻弧菌免疫分离免疫血清免疫磁珠蛋白A亲和层析抗体纯化
分类号: S941
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 75次
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内容摘要

近年来,我国海水养殖业发展迅速,特别是高密度养殖模式的推广,造成养殖生物细菌性疾病发生的频率和范围逐渐扩大。由于溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是海洋优势弧菌之一,故由溶藻弧菌引起的养殖品种的病害也占有很高比例。由溶藻弧菌引起的鱼、虾、贝类等养殖品种致病,对我国养殖经济造成很大损失。目前我国对于养殖经济品种溶藻弧菌等的细菌性疾病的治疗,主要依靠投放大量的抗生素,长此以往不仅使病原菌产生了耐药性,而且由于药物的残留同时也对人类的健康造成重大威胁。因此建立溶藻弧菌的快速、准确、敏感检测方法是十分重要的。即能够在早期诊断出溶藻弧菌潜在的致病威胁,还可以在早期进行治疗和预防,这样可以在一定程度上减少抗生素的使用,提高养殖品种的存活率。而且建立起的检测方法还可以用于水产品的安全检测,避免食物中的溶藻弧菌对人类健康造成威胁。免疫磁珠分离技术(immunomagnetic separation,MS)是以免疫磁珠为基础发展起来的免疫检测技术,是以抗体包被的磁珠为载体,利用抗原抗体的特异性反应,在反应体系中形成抗原-抗体磁珠复合物,该复合物在磁场的作用下做定向运动,从而达到分离抗原的作用。免疫磁珠分离技术不仅兼具固相化试剂特有的优点和免疫学反应的高度专一性等特点,而且分离时间短、速度快、分离效率高,不影响被分离生物材料的生物学性状和功能,因此成为近年来国内外比较热门的一种新的免疫学技术,并在生物大分子与细胞的分离检测方面表现出广阔的应用前景。本研究就是以该技术为基础,建立快速、高效的溶藻弧菌免疫磁珠快速检测技术,实验结果如下:1)通过石碳酸灭活法制备溶藻弧菌抗原,用以免疫新西兰大白兔,颈动脉取血法共收集150mL抗血清,其凝集效价为1:5120。通过蛋白A柱亲和层析法从10mL抗血清纯化出浓度为2.8579mg/mL的兔抗溶藻弧菌IgG共40mL。改良ELISA法测定IgG的效价为1:256000。2)利用ELISA法检测溶藻弧菌兔抗IgG的包被效果。结果为2μL免疫磁珠的最大结合量为0.5μg/mL。最佳结合时间为5min。不同pH值,离子浓度对IgG与磁珠的结合无明显影响。3)初步建立了溶藻弧菌免疫磁珠的检测技术:用已包被兔抗溶藻弧菌IgG的免疫磁珠检测溶藻弧菌,结果为1mL菌液中免疫磁珠的最佳加入量(最佳工作浓度)为20μL,最佳反应时间为20min。免疫磁珠检测敏感性为2.8cfu/mL。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第1章引言  10-22
  1.1 溶藻弧菌的研究现状  10-15
    1.1.1 溶藻弧菌及其流行病学  10-12
    1.1.2 溶藻弧菌的致病性研究  12-13
    1.1.3 溶藻弧菌的检测  13-15
  1.2 免疫磁珠的概况  15-19
    1.2.1 免疫磁珠  15
    1.2.2 免疫磁珠的结构及性质  15-16
    1.2.3 免疫磁珠的应用  16-19
  1.3 酶联免疫检测方法  19-20
    1.3.1 酶联免疫吸附实验的基本概况  19
    1.3.2 酶联免疫吸附法的基本原理  19
    1.3.3 直接法  19
    1.3.4 间接法  19-20
    1.3.5 双抗夹心法  20
    1.3.6 竞争法  20
  1.4 研究目的与意义  20-21
  1.5 研究内容  21-22
第2章溶藻弧菌免疫血清的制备及兔抗IGG 的纯化  22-32
  2.1 材料和方法  22-28
    2.1.1 实验材料  22-25
    2.1.2 实验方法  25-28
  2.2 结果与分析  28-31
    2.2.1 兔抗血清的制备  28
    2.2.2 蛋白A 柱亲和层析法纯化IgG 结果  28-29
    2.2.3 SDS-PAGE 电泳结果  29-30
    2.2.4 亲和层析法纯化兔抗溶藻弧菌IgG 效价测定结果  30-31
  2.3 讨论  31-32
第3章免疫磁珠与兔抗溶藻弧菌IGG 的结合及条件优化  32-39
  3.1 材料与方法  32-35
    3.1.1 实验材料  32-34
    3.1.2 实验方法  34-35
  3.2 结果与分析  35-37
    3.2.1 IMB 与IgG 最大包被量的检测  35
    3.2.2 IMB 与IgG 结合时间的检测  35-36
    3.2.3 离子浓度对IMB 与IgG 结合的影响  36
    3.2.4 pH 值对IMB 与IgG 结合的影响  36-37
  3.3 讨论  37-39
第4章免疫磁珠技术在溶藻弧菌检测中的方法研究  39-44
  4.1 材料和方法  39-41
    4.1.1 实验材料  39-40
    4.1.2 实验方法  40-41
  4.2 结果与分析  41-42
    4.2.1 免疫磁珠检测溶藻弧菌最佳工作浓度的确定  41
    4.2.2 免疫磁珠检测溶藻弧菌最佳反应时间确定  41-42
    4.2.3 免疫磁珠检测溶藻弧菌的敏感性  42
  4.3 讨论  42-44
第5章小结与展望  44-45
  5.1 小结  44
  5.2 展望  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-54
在学期间发表的学术论文  54

用于溶藻弧菌快速检测的免疫磁珠技术的研究

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