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溶藻弧菌主要毒力相关基因的克隆、表达及其免疫原性研究

作　者: 钱荣华
导　师: 于涟
学　校: 浙江大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 溶藻弧菌 毒力因子 克隆 表达 特征分析 免疫原性 大黄鱼
分类号: S941
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


溶藻弧菌是人和海洋动物共感染的一种主要病原弧菌，广泛分布于海洋和河口，是中国四大海产经济鱼类之一的大黄鱼危害最严重的一种主要病原菌。可引起鱼体伤口感染、炎症反应和败血症等症状，发病率高，流行面广，造成经济损失巨大。本论文主要从溶藻弧菌主要毒力相关基因着手，通过克隆构建和体外表达，以表达的重组蛋白为抗原，制备基因工程亚单位疫苗，对由溶藻弧菌引起的大黄鱼弧菌病进行免疫预防研究。用分离菌株ZJ04107和溶藻弧菌标准参考株17700进行人工感染试验，结果证明ZJ04107菌株是大黄鱼的病原菌。经进一步的生理生化鉴定和16SrRNA基因序列的分子水平鉴定，结果表明分离株ZJ04107为溶藻弧菌。分离株ZJ04107的LD50为2.0×107CFU，标准参考株17700为8.0×107CFU。药敏试验结果表明：头孢曲松、复方新诺明、依诺沙星、氧氟沙星、四环素和壮观霉素对该分离菌有明显的抑制作用。克隆到溶藻弧菌6个主要毒力相关基因：铁调蛋白基因（fur）、鞭毛蛋白基因（flaA）、胶原酶基因（valC）、碱性丝氨酸蛋白酶基因（aspA）、外膜蛋白OmpK基因（ompK）和OmpW基因（ompW）。上述基因编码相应成熟蛋白（16.8 kDa、39.8 kDa、89 kDa、56 kDa、31.3 kDa和23.3kDa）的基因片段分别亚克隆到原核表达载体pET-30a（+），构建重组表达质粒（pET-Fur、pET-FlaA、pET-ValC、pET-AspA、pET-OmpK和pET-OmpW）。SDS-PAGE结果表明，各重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中获得大量表达。带His-Tag的重组蛋白经镍亲和层析得到纯化，Western blot分析结果显示，各重组蛋白具有免疫反应性。应用生物信息学方法和相关软件，对6个主要毒力相关基因编码蛋白的高级结构分别进行了同源比较建模，预测到各蛋白质的三级结构模型，有助于进一步研究各蛋白的相关功能。应用重叠延伸剪切技术，将aspA和ompW二个基因，分别经三次PCR获得融合基因片段aspA-ompW和ompW-aspA，定向插入原核表达载体pET-30a（+）中，筛选阳性克隆，经酶切及PCR鉴定，并通过DNA测序证实，成功构建了融合基因原核表达质粒pET-AspA-OmpW和pET-OmpW-AspA。融合基因质粒在大肠杆菌中获得表达，重组融合蛋白经镍亲和层析得到进一步纯化，Western blot分析结果显示，二种融合蛋白都具有免疫反应性。将各主要毒力相关基因表达的重组蛋白（FlaA、AspA、OmpW、OmpK、OmpW-AspA）及四种重组蛋白平均组合的混合蛋白FAWK（FlaA、AspA、OmpW、OmpK、）和全菌灭活苗（FKC）作为抗原分别免疫大黄鱼，ELISA检测抗体效价结果表明，所有免疫组鱼都可检测到抗体，免疫组和非免疫对照组间差异显著（P＜0.05），且在第五周各重组蛋白免疫组鱼抗体水平达到峰值，FAWK抗体水平比FKC高，OmpW-AspA产生的抗体水平和FKC基本相当，在单个重组蛋白免疫组中FlaA和OmpW诱导产生的抗体水平较高，而OmpK和AspA相对较低。攻毒试验结果表明，免疫组鱼对抗溶藻弧菌感染产生的免疫保护率以FAWK最高（85.2％），其次为OmpW-AspA和FKC（81.5％），单个重组蛋白免疫组中，以FlaA和OmpW最高（77.8％），而AspA最低（63.0％）。因此，FlaA和OmpW可作为溶藻弧菌基因工程亚单位疫苗的候选；二个及二个以上的毒力相关基因融合表达的重组蛋白（OmpW-AspA）或单个毒力相关基因表达蛋白的组合（FAWK）对免疫效果具有增强作用，为制备溶藻弧菌基因工程亚单位苗奠定基础。对铁调蛋白基因（fur）的序列特征和Fur的部分功能进行了分析。在fur基因450bp编码序列的上下游，RBS序列、-10序列、-35序列和二个潜在的转录终止子分别得到确定，序列的中段从G46位至D104位，为高度保守区域，其中包括含组氨酸丰富的铁结合模型（H3-D-H-L-V-C-L-D-C-G）。但没有发现类似于大肠杆菌fur基因中的“铁盒子”，说明fur和其他弧菌一样并不能自我调控。互补试验表明，溶藻弧菌的fur能功能性的互补fur缺陷的E．coli H1681。结合Fur的三维模型，为进一步研究fur对摄铁系统和其他毒力基因的调控等功能奠定基础。

全文目录


摘要  9-11
Abstract  11-14
第一部分 文献综述  14-43
  第一章 溶藻弧菌的生物学特性及毒力因子研究进展  15-28
    1 溶藻弧菌的生物学特性  15-17
    2 溶藻弧菌的毒力因子及致病性  17-22
    参考文献  22-28
  第二章 鱼类基因工程疫苗研究进展  28-43
    1 鱼类的免疫系统  28-30
      1.1 鱼类的免疫器官与组织  28-29
      1.2 鱼类的免疫应答类型  29-30
    2 鱼类疫苗的发展历程  30-31
    3 鱼类基因工程疫苗  31-36
      3.1 基因工程亚单位疫苗  32-33
      3.2 基因工程活载体疫苗  33-34
      3.3 核酸疫苗  34-35
      3.4 抗独特型疫苗  35-36
    4 展望  36-37
    参考文献  37-43
第二部分 研究内容  43-144
  第三章 溶藻弧菌的鉴定  44-53
    1 材料与方法  45-46
      1.1 病原菌的分离  45
      1.2 人工感染试验和LD_(50)测定  45
      1.3 病原菌的再分离与生化鉴定  45-46
      1.4 病原菌的16S rRNA基因序列分析  46
      1.5 病原菌药敏试验  46
    2 结果  46-50
      2.1 人工感染试验和LD_(50)测定  46-47
      2.2 病原菌的生化鉴定结果  47-48
      2.3 病原菌的16S rRNA鉴定结果  48-50
      2.4 药敏试验结果  50
    3 讨论  50-51
    参考文献  51-53
  第四章 溶藻弧菌铁调蛋白和鞭毛蛋白基因的克隆、表达及其特征分析  53-71
    1 材料与方法  55-59
      1.1 细菌菌株和质粒  55-56
      1.2 工具酶与试剂  56
      1.3 溶藻弧菌总DNA的提取  56
      1.4 引物的设计与fur基因的克隆  56
      1.5 序列特征和生物信息学分析  56-57
      1.6 重组表达载体的构建与原核表达  57
      1.7 表达产物纯化  57-58
      1.8 兔抗血清制备  58
      1.9 SDS-PAGE和Western blot分析  58
      1.10 fur的功能性互补  58-59
    2 结果  59-66
      2.1 fur和flaA基因的克隆  59
      2.2 序列特征  59-62
      2.3 Fur和FlaA蛋白的高级结构预测  62-65
      2.4 表达分析  65
      2.5 fur的功能性互补  65-66
    3 讨论  66-68
    参考文献  68-71
  第五章 溶藻弧菌二个蛋白酶类主要毒力相关基因的克隆和表达  71-93
    1 材料和方法  73-84
      1.1 菌株、质粒和试剂  73
      1.2 细菌DNA抽提  73
      1.3 引物设计与基因片段的PCR扩增  73-76
      1.4 重组表达质粒pET-ValC和pET-AspA的构建  76-81
      1.5 重组质粒的原核表达及表达产物纯化  81-82
      1.6 表达产物的SDS-PAGE检测  82-83
      1.7 融合蛋白多克隆抗体的制备  83
      1.8 表达产物的Western blot分析  83-84
      1.9 蛋白高级结构的预测和生物信息学分析  84
    2 结果  84-89
      2.1 目的基因PCR扩增结果  84-85
      2.2 ValC和AspA蛋白高级结构的预测  85-87
      2.3 重组质粒的鉴定  87-88
      2.4 重组融合蛋白的表达检测  88-89
    3 讨论  89-90
    参考文献  90-93
  第六章 溶藻弧菌二种主要外膜蛋白基因的克隆、表达和特征分析  93-109
    1 材料与方法  95-99
      1.1 细菌菌株和质粒  95-96
      1.2 工具酶与试剂  96
      1.3 基因组提取  96
      1.4 基因克隆  96-97
      1.5 序列特征和生物信息学分析  97
      1.6 重组表达载体的构建与原核表达  97-98
      1.7 表达产物纯化  98
      1.8 兔抗血清制备  98
      1.9 SDS-PAGE和Western blot分析  98-99
    2.结果  99-106
      2.1 基因克隆结果  99-100
      2.2 序列特征  100-103
      2.3 蛋白高级结构预测  103-104
      2.4 重组蛋白的表达与检测  104-106
    3.讨论  106-107
    参考文献  107-109
  第七章 ompW-aspA融合基因表达载体的构建及表达  109-130
    1 材料和方法  110-119
      1.1 宿主菌株和载体  110
      1.2 试验试剂  110-111
      1.3 融合基因的PCR扩增  111-115
      1.4 重组质粒pET-AspA-OmpW和pET-Omp W-AspA的构建  115-118
      1.5 重组质粒的原核表达及表达产物纯化  118
      1.6 表达产物的SDS-PAGE检测和Western blot分析  118-119
    2 结果  119-126
      2.1 引物设计和目的基因PCR扩增  119
      2.2 融合基因原核表达的构建  119-121
      2.3 重组质粒的鉴定  121-124
      2.4 重组融合蛋白的表达检测  124-126
    3 讨论  126-127
    参考文献  127-130
  第八章 溶藻弧菌主要毒力相关基因表达重组蛋白的免疫原性研究  130-141
    1 材料与方法  132-134
      1.1 试验菌株和培养基  132
      1.2 试验鱼  132
      1.3 抗原准备  132
      1.4 安全性评估  132
      1.5 免疫  132-133
      1.6 攻毒菌液准备  133
      1.7 采血与攻毒  133
      1.8 兔抗血清准备  133
      1.9 间接ELISA检测抗体效价  133-134
    2 结果  134-138
      2.1 安全性评估  134
      2.2 抗体效价  134-136
      2.3 免疫保护率  136-138
      2.4 病原菌检测  138
    3 讨论  138-139
    参考文献  139-141
  第九章 总结与展望  141-144
    1 主要结论和创新点  141-143
    2 展望  143-144
第三部分 附录  144-151
  附录1 常用试剂及培养基配方  145-150
  附录2 攻读博士学位期间发表(录用)的学术论文  150-151
致谢  151-152

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 鱼病学
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