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小麦高分子量谷蛋白亚基1Bx13和1By16单克隆抗体制备及其应用研究

作　者: 李巧云
导　师: 晏月明
学　校: 首都师范大学
专　业: 植物学
关键词: 小麦品质高分子量谷蛋白亚基 1Bx13和1By16 单克隆抗体 ELISA 抗原决定簇
分类号: S512.1
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

小麦的烘烤品质不仅与贮藏蛋白的含量有关，而且还与其组成有关。烘烤品质的测定通常需要比较昂贵的仪器，如：粉质仪、拉伸仪、和面仪等，这些仪器难以在各育种单位普及。另外，利用上述仪器进行分析时，需要较大的样品量，这在育种的早代难以实现。虽然沉淀值、凯氏定N等方法较为经济，但其效率却较低。最近，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，因具有成本低、耗费少、所需样品量少以及样品处理简单等优点，已开始用于品质预测和筛选。利用这种方法测定小麦品质，关键是要制各适宜的抗体，尤其是单克隆抗体。研究表明，HMW-GS 1Bx13和1By16是对烘烤品质影响较大的优质亚基，因此，制备这两个亚基的单克隆抗体更有应用价值。而且，由于这两个亚基的基因还未克隆，以1Bx13和1By16亚基为抗原制备单克隆抗体还可以用于筛选cDNA表达文库，从而克隆这两个亚基及其它贮藏蛋白基因。本研究以斯卑尔脱小麦Somiedo为材料，分别采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)、双向A-PAGE×SDS-PAGE、等电聚焦×SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF×SDS-PAGE)、高效毛细管电泳(HPCE)、高效液相色谱(HPLC)以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)等方法对高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)进行分离鉴定。采用电泳法分离纯化1Bx13和1By16亚基，并以这两个亚基为抗原免疫BALB/C小鼠，采用杂交瘤技术制备相应抗原的单克隆抗体，并采用间接ELISA方法结合SPSS软件分析，研究所制备单克隆抗体在预测小麦烘烤品质及亚基鉴定方面的应用。另外，还进行了HMW-GS及LMW-GS抗原表位分析。主要研究结果如下： 1．HMW-GS的分离鉴定目前用于HMW-GS分离鉴定的方法较多，其中，以PAGE方法最为经济。双向电泳(2-DE)的分辨率最高，且可对蛋白质的等电点进行研究。HPLC不仅可用于分离鉴定，还可回收纯化单个亚基，但所需流动相量大，仪器比较昂贵，分析成本较高。HPCE相对于HPLC来说较为经济，与PAGE相比可以避免有毒药品的使用，因此是一种比较理想的分离鉴定HMW-GS的方法。本研究中的斯卑尔脱小麦Somiedo含有五个HMW-GS(1，13+16，2+12)，均能利用上述方法进行分离鉴定。2-DE分析结果表明，从等电点来看，该品种所含有的HMW-GS主要分布在碱性区域，而且1Bx13和1By16较其它三条亚基的

全文目录

第一章综述  15-44
  一、小麦品质与高分子量谷蛋白亚基  15-23
    1.小麦品质概述  15-17
    2.高分子量谷蛋白亚基研究进展  17-23
  二、抗体及其研究进展  23-30
    1.抗原的制备  24-25
    2.抗体的制备  25-30
  三、抗体在植物学及农业研究中的应用  30-36
    1.植物学及农业研究中常用的免疫化学方法  30-34
    2.抗体在植物学及农业研究中的应用进展  34-36
  四、单克隆抗体在小麦贮蛋白研究及品质改良中的应用  36-43
    1.检测贮藏蛋白的免疫同源性  36-38
    2.测定小麦品质性状  38-39
    3.作为探针筛选cDNA文库  39-40
    4.利用单抗鉴定LMW-GS等位基因变异  40-41
    5.研究染色体组或品种间关系及其基因遗传表达  41
    6.利用免疫细胞化学方法研究某些特异性蛋白的发育与定位  41-42
    7.研究蛋白质结构及其相互作用  42-43
  五、本研究思路与目标  43-44
第二章小麦高分子量谷蛋白亚基1B_X13和1B_Y16的分离纯化  44-62
  一、实验材料  44
  二、实验方法  44-54
    1.聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)  44-50
    2.HPCE、HPLC及MALDI-TOF-MS分析  50-54
  三、结果与分析  54-59
    1.HMW-GS的PAGE分析  54-56
    2.2-DE分析  56
    3.RP-HPLC分析  56-57
    4.HPCE分析  57-59
    5.MALDI-TOF-MS分析  59
  四、讨论  59-61
  五、小结  61-62
第三章高分子量谷蛋白亚基1B_X13和1B_Y16单克隆抗体的制备  62-80
  一、实验材料  62-63
    1.小麦材料  62
    2.实验动物和细胞  62
    3.主要试剂  62-63
    4.耗材及主要仪器  63
  二、实验方法  63-72
    1.溶液配制  63-66
    2.抗原纯化  66-67
    3.单克隆阳性杂交瘤细胞系的建立  67-72
  三、结果与分析  72-77
    1.抗原纯化  72-73
    2.单克隆阳性杂交瘤细胞系的建立  73-76
    3.单克隆抗体的大量制备  76-77
  四、讨论  77-79
    1.关于抗原制备方法  77
    2.小鼠免疫方法及免疫用量  77-78
    3.影响细胞融合的因素  78
    4.克隆及亚克隆应注意的问题  78-79
  五、小结  79-80
第四章 1B_X13和1B_Y16单克隆抗体的鉴定及特异性分析  80-97
  一、实验材料  80-81
    1.小麦材料  80-81
    2.单克隆抗体  81
    3.主要试剂  81
    4.耗材及主要仪器  81
  二、实验方法  81-86
    1.溶液配制  81-83
    2.操作步骤  83-86
  三、结果与分析  86-91
    1.杂交瘤细胞的染色体分析  86
    2.单克隆抗体的亚型鉴定  86-87
    3.IgM单抗轻重链的分子量鉴定  87-88
    4.单克隆抗体的特异性分析  88-91
  四、讨论  91-95
    1.杂交瘤细胞的染色体基因的丢失问题  91-92
    2.免疫球蛋白与单克隆抗体的亚型  92-93
    3.抗体的纯化  93-94
    4.贮藏蛋白单克隆抗体的特异性  94-95
  五、小结  95-97
第五章单克隆抗体在小麦品质预测及亚基鉴定上的应用  97-108
  一、实验材料  97-98
  二、实验方法  98-99
    1.溶液配制  98
    2.样品提取  98-99
    3.ELISA  99
    4.数据分析  99
  三、结果与分析  99-102
    1.单克隆抗体在小麦品质测定中的应用  99-100
    2.利用单克隆抗体鉴定粗山羊草中含有1Dx5+1Dy10亚基的优质基因型  100-102
  四、讨论  102-107
    1.面粉品质参数及其与烘烤品质的关系  102-103
    2.小麦品质测定中的酶联免疫吸附测定法  103-105
    3.免疫化学测定法分析不同品质参数的效果  105
    4.单克隆抗体在鉴定特定亚基方面的应用  105-106
    5.免疫化学方法在小麦品质改良中的应用现状与前景  106-107
  五、小结  107-108
第六章麦谷蛋白抗原表位分析  108-128
  一、实验材料  108
  二、实验方法  108
  三、结果与分析  108-126
  四、讨论  126-127
  五、小结  127-128
结论  128-129
参考文献  129-148
作者简历  148-149
致谢  149

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