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人白细胞介素15真核基因表达及对小鼠肺腺癌的基因治疗

作　者: 薛莉
导　师: 巴德年；何维；崔莲仙
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 人白细胞介素15(IL-15) 基因修饰肿瘤细胞真核基因表达裸质粒DNA注射基因治疗抗原呈递细胞毒
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 1999年
下　载: 71次
引　用: 1次
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内容摘要

白细胞介素（IL）-15具有与IL-2相似的生物学功能，能够促进T、B细胞和NK细胞增殖分化，增强CTL／NK细胞毒活性，并能发挥优于IL-2的抗肿瘤作用。本论文是在我们前期工作基础上深入探讨人（h）IL-15在真核细胞内表达和hIL-15基因修饰瘤苗以及IL-15裸基因对小鼠肺腺癌的基因治疗作用。我们前期工作结果表明，hIL-15 cDNA转染的小鼠肺腺癌细胞LA795A与野生型LA795细胞和空载体转染细胞LA795neo相比，在同基因型T739小鼠体内的致瘤性明显下降。裸鼠实验证实这种抑瘤性至少为T细胞依赖的，且CD8⁺T细胞为主要的效应细胞。本论文研究进一步发现，经受LA795A肿瘤细胞接种小鼠的存活率明显高于LA795和LA795neo细胞攻击小鼠，其最长存活时间延长了20天。分别将LA795A、LA795neo和LA795三种细胞用⁶⁰Co照射去增殖，作为瘤苗腹腔免疫T739小鼠后，再以不同浓度的野生型LA795肿瘤细胞进行攻击，发现LA795A肿瘤细胞免疫对T739小鼠肿瘤发生有一定的保护作用。T739荷瘤小鼠经去增殖的LA795A细胞早期治疗后，肿瘤生长虽未得以消退但受到显著抑制，取得较好疗效。经过分析，IL-15基因修饰瘤苗治疗组小鼠脾细胞的特异性CTL和非特异性NK细胞毒活性均高于其它对照组，但以NK水平增高明显。这提示，IL-15基因转染的肿瘤细胞分泌的IL-15可能通过提高机体的CTL和NK细胞毒作用来增强对肿瘤的杀伤能力。进一步观察发现，IL-15基因转染肿瘤细胞后，细胞表面的Ⅰ类MHC分子表达显著降低，推测肿瘤抗原可能是通过宿主抗原呈递细胞（APC）间接呈递给CD8⁺T细胞的。同时，基因修饰肿瘤细胞分泌的IL-15可能通过增强宿主APC对肿瘤抗原的呈递能力，促进CD4⁺T细胞对CD8⁺CTL的活化，直接或间接增强CTL活性，或通过TCR非依赖方式选择刺激记忆表型CD44^hiCD8⁺T细胞增殖，来增强记忆细胞毒杀瘤活性。此外，肿瘤细胞表面Ⅰ类MHC分子水平的降低可解除NK细胞和部分CD8⁺T细胞表面杀伤细胞抑制受体（KIRs）对细胞毒功能的抑制作用，可能也是CTL，尤其NK细胞毒作用增强的重要原因。健康人外周血单个核细胞对人PG、PGneo和PG1肺鳞癌细胞的体外NK细胞毒实验进一步证实，NK细胞对Ⅰ类MHC分子表达水平显著降低的PG1细胞的杀伤能力明显增强。 hIL-15基因修饰瘤苗虽然在小鼠体内表现出较好的抑制肿瘤作用，但肿瘤细胞中IL-15的分泌量很少。为了解决问题，我们重新构建了人IL-15 cDNA真核表达载体，以期在哺乳类细胞中获得高效稳定表达。本论文以含有hIL-15 cDNA（574 bp）的测序质粒pBS-SK-IL-15为模板，从编码信号肽的起始密码子AUG开始设计引物，采用PCR技术扩增出hIL-15cDNA 486 bp的全编码序列（去除了所有非编码区），并与pcDNA3质粒的EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ位点定向连接，构建受控于人巨细胞病毒（CMV）启动子的重组真核表

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-9
英文缩略语  9-11
前言  11-13
实验材料  13-17
实验方法  17-30
实验结果  30-73
  第一部分  30-42
  第二部分  42-54
  第三部分  54-73
讨论  73-79
小结  79-80
参考文献  80-85
综述一  85-102
综述二  102-106
致谢  106-107
个人简历  107

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