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东亚钳蝎昆虫毒素BmK IT中关键活性位点的功能分析

作　者: 杨仁佳
导　师: 付月君
学　校: 山西大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 东亚钳蝎 兴奋性昆虫神经毒素BmK IT 细胞毒性 作用机制
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


蝎毒素是由28-76个氨基酸组成的一组多肽混合物。这类多肽主要与细胞膜上的各种离子通道发生特异性的相互作用。因此蝎毒素被认为是研究离子通道结构的很好的探针材料和研究蛋白质结构功能关系的良好模型。BmK IT是从广泛分布于我国的东亚钳蝎中克隆出来的兴奋型昆虫毒素。该蛋白由69个氨基酸组成,分子内含有4对二硫键。本研究将着重研究BmK IT中关键活性位点对其体外活性的影响。到目前为止,蝎兴奋型毒素中,只有Bj-xtrIT和BmK IT-AP的蛋白质晶体结构和BmK-βIT的NMR结构被解析出来。通过结构解析和定点突变试验,提出p-兴奋型毒素含有两个重要的结合区域和一个功能位点：(i)包含有热点(hot spot)在内的α螺旋区域；(ii)被认为是决定毒素作用Na+通道种属特异性的C端疏水氨基酸(对于昆虫Na+通道)或是β2及β3折叠(对于哺乳动物Na+通道)；(iii)有着“电压传感器’功能的带负电的Glu15。利用SWISS-MODEL服务器对BmK IT毒素进行三维结构同源建模,结果表明：BmK IT三维构象与BmK IT-AP、Bj-xtrIT、BmKβIT相似。因此我们定点突变得到了其突变体rBmK IT(I25E)、rBmK IT(E15G)和rBmK IT (C-terminal truncated),检测BmK IT中这些关键位点的功能。利用重组表达载体pTWIN1成功表达了融合蛋白DnaB-rBmK IT(及突变体)-His6。融合蛋白可结合在Ni-NTA亲和柱上并在氧化还原缓冲液中进行正确的二硫键配对。当pH调至6.5时Intein发生自剪切从而得到目的蛋白rBmK IT-His6。圆二色谱分析表明表达纯化所得到的目的蛋白rBmK IT、rBmK IT(I25E)、rBmK IT(E15G)和rBmK IT(C-terminal truncated)的二级结构相同。在细胞毒性检测MTT实验中,活细胞生成甲瓒的量与490nm处的吸光值在一定范围内呈线性关系,根据这种线性关系,可以通过OD490间接反映每孔中活细胞的数量。我们分别将不同浓度的蛋白rBmK IT、rBmK IT(I25E)、rBmK IT(E15G)和rBmK IT (C-terminal truncated)加入96孔板中,孔中预铺Sf9或C6细胞,测定不同浓度蛋白对Sf9细胞及C6细胞的细胞毒作用。结果显示,随着加入蛋白rBmK IT浓度的增加,Sf9活细胞数量呈先增加(rBmK IT浓度为0μM -10μM)后减少(rBmK IT浓度为10μM -30μM)的趋势,其拐点为10μM。根据其产生拐点所对应的蛋白浓度的不同可以推断rBmK IT(I25E)(拐点对应蛋白浓度为5μM)将Ile25突变为热点Glu25可使Sf9细胞对蛋白的敏感性增强,rBmK IT(E15G)(拐点对应蛋白浓度为20μM)将电压传感器诱捕位点Glu15突变为Gly15可使Sf9细胞对蛋白的敏感性降低。而rBmk IT(C-terminal truncated)将C端疏水端截短可使蛋白跨越种属界限而对大鼠神经胶质瘤C6细胞产生作用(对C6细胞其拐点对应蛋白浓度为10 gM)。在全细胞膜片钳实验及far-western实验中,均无法检测出Sf9细胞中电压依赖性钠离子通道的存在。因此,设计了共定位实验来检测细胞中Na+通道。由于河豚毒素TTX可以与Na+通道蛋白特异性结合,依次加入TTX、兔抗TTX抗体以及TRITC标记的羊抗兔抗体对钠离子通道进行定位实验。同理,依次加入rBmK IT蛋白或其突变体、鼠抗His抗体及FITC标记的羊抗鼠抗体对rBmK IT.rBmK IT(I25E)、rBmK IT(E15G)和rBmK IT(C-terminal truncated)进行定位实验。共定位实验结果表明,Sf9细胞和C6细胞细胞膜上均有钠离子通道的存在。rBmK IT、rBmK IT(I25E)与rBmK IT(E15G)在细胞膜上的作用位点与Sf9细胞膜上的钠离子通道的定位点重合,初步证实了rBmK IT、rBmK IT(I25E)与rBmK IT(E15G)在Sf9细胞上可与Na+通道相互作用,rBmK IT(C-terminal truncated)在细胞膜上的作用位点与Sf9细胞膜上的钠离子通道的定位点没有重合或重合很少,证明rBmK IT(C-terminal truncated)在Sf9细胞上与Na+通道的作用能力有限。而在C6细胞上,只有rBmK IT(C-terminal truncated)的作用位点能与C6细胞膜上的钠离子通道的定位点重合,证明rBmK IT的C端截短肽可作用于C6细胞Na+通道。rBmK IT的结晶实验利用Hampton Research公司的晶体生长试剂盒中的50个缓冲液配方、采用悬滴法筛选rBmK IT的结晶条件。在温度28℃,缓冲液配方为0.1 M磷酸二氢钾,0.1 M—水合磷酸二氢钠,0.1 M—水合吗啉乙磺酸,2.0 M氯化钠(pH6.5),时间为6个月时生长出五边形晶体。本研究检测了rBmK IT中关键氨基酸位点对其发挥活性的作用,分析了其分子作用机制,深化了对rBmK IT的结构与功能的认识。

全文目录


中文摘要  12-14ABSTRACT  14-18第一章 文献综述  18-28  1 引言  18  2 蝎昆虫毒素的结构研究  18-22    2.1 兴奋型蝎昆虫毒素与哺乳动物毒素结构比较  18-19    2.2 兴奋型蝎昆虫毒素的结构特点  19-22  3 蝎昆虫神经毒素的活性测定方法  22-24    3.1 毒理学方法  22-23    3.2 电生理学方法  23-24    3.3 竞争结合试验  24  4 蝎毒素作用电压门控钠通道的研究进展  24-26    4.1 β兴奋型毒素在钠离子通道上的作用位点  24-25    4.2 β兴奋型毒素在钠离子通道上的作用机制  25-26  5 论文的设计思路  26-28    5.1 研究背景  26-27    5.2 实验目的  27    5.3 技术方案及流程  27    5.4 研究的创新点  27-28第二章 BmK IT及其突变体BmK IT(E15G)、BmK IT(125E)、BmK IT(C-terminaltruncated)的表达、纯化、鉴定  28-41  1 实验材料  28-30    1.1 菌株和质粒  28    1.2 主要试剂的配制  28-29    1.3 主要的酶和生化制剂  29-30    1.4 主要实验仪器  30  2 实验方法  30-37    2.1 寡居核苷酸引物的设计  30-31    2.2 BmK IT的定点突变  31-33    2.3 重组质粒pTWIN1-BmK IT-E15G,pTWIN1-BmK IT-125E,pTWIN1-BmKIT-C-terminal truncated的构建  33-35    2.4 rBmK IT及rBmK IT(E15G)、rBmK IT(I25E)、rBmK IT(C-terminal truncated)三种突变体的表达纯化  35-36    2.5 rBmK IT及其三种突变体的Western blot检测  36-37  3 实验结果  37-40    3.1 重组质粒pTWIN1-BmK IT-E15G,pTWIN1-BmK IT-I25E,pTWIN1-BmK IT C-terminal truncated的检测  37    3.2 PCR鉴定结果  37-38    3.3 突变重组质粒测序  38    3.4 rBmK IT及其三种突变体的表达和纯化  38-39    3.5 rBmK IT及其三种突变体的Western blot检测  39    3.6 重组BmK IT及其突变体的圆二色谱分析  39-40  4 讨论  40-41第三章 rBmK IT及突变体对昆虫细胞株Sf9和哺乳动物细胞株C6的细胞毒作用分析  41-50  1 实验材料  41-43    1.1 细胞和质粒  41    1.2 主要的生化制剂及材料  41    1.3 主要试剂的配制  41-42    1.4 主要实验仪器  42-43  2 实验方法  43-45    2.1 实验用细胞的培养  43    2.2 MTT法检测rBmK IT及其突变体对昆虫细胞Sf9及大鼠细胞C6增殖的影响  43-44    2.3 全细胞膜片钳技术对rBmK IT的电生理学性质的确定  44-45  3 实验结果  45-48    3.1 MTT法检测rBmK IT及其突变体对昆虫细胞Sf9及大鼠神经胶质瘤细胞C6增殖的影响  45-47    3.2 膜片钳技术对rBmK IT的电生理学性质的确定  47-48  4 讨论  48-50第四章 rBmK IT及其突变体对Sf9及C6细胞作用的分子机制研究  50-60  1 实验材料  50-52    1.1 细胞和质粒  50    1.2 主要的酶和生化制剂及耗材  50-51    1.3 主要试剂的配制  51    1.4 主要实验仪器  51-52  2 实验方法  52-55    2.1 实验用细胞的培养  52    2.2 rBmK IT及其突变体与TTX在Sf9细胞上的共定位实验  52-53    2.3 rBmK IT及其突变体与TTX在C6细胞上的共定位实验  53-54    2.4 Far-Western blot法比对昆虫Sf9细胞和C6细胞钠通道蛋白的表达量  54-55  3 实验结果  55-58    3.1 BmK IT及其突变体与TTX在Sf9细胞上的共定位实验  55-56    3.2 BmK IT及其突变体与TTX在C6细胞上的共定位实验  56-58    3.3 Far-Western blot法比对昆虫Sf9细胞和C6细胞钠通道α亚基蛋白的表达量  58  4 讨论  58-60第五章 BmK IT三维结构建模及晶体生长条件初筛  60-68  1 实验材料  60    1.1 实验用蛋白及相应耗材  60    1.2 主要实验仪器  60  2 实验方法  60-64    2.1 PDB蛋白质结构数据库及同源序列分析  60    2.2 SWISS-MODE蛋白质同源建模服务器和DeepView(Swiss Pdb-Viewer)程序分析  60-61    2.3 模型表面静电势分析  61    2.4 结晶条件和方法  61-64  3 实验结果  64-67    3.1 BmK IT同源建模模板的分析及SWISS-MODEL服务器对BmK IT的建模  64-65    3.2 BmK IT表面静电势分析  65-66    3.3 BmK IT蛋白质结晶条件的初步摸索  66-67  4 讨论  67-68参考文献  68-72总结与展望  72-74附录Ⅰ  74-75附录Ⅱ  75-77  一.攻读学位期间取得的研究成果  75-76  二.参与的科研项目  76  三.参加的学术会议  76-77致谢  77-78个人简况及联系方式  78-80

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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