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携带hIL12-p40-L△p35的双靶向溶瘤腺病毒联合CIK细胞的抗癌作用研究

作　者: 徐科
导　师: 钱程
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 溶瘤腺病毒 病毒基因治疗 hIL12-p40-L△p35 CIK细胞治疗
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 4次
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内容摘要


本文中对携带hIL12-p40-LΔp35的双靶向溶瘤腺病毒抗癌作用作了一定研究。溶瘤腺病毒(又称肿瘤特异性增殖腺病毒)目前是一类充满希望的抗肿瘤药物,它能特异性地在肿瘤细胞中复制、增殖,从而达到杀死肿瘤细胞的目的。利用溶瘤腺病毒携带治疗基因既保留了病毒杀伤肿瘤细胞的能力,同时伴随着病毒在肿瘤细胞中的复制,治疗基因在癌细胞中的表达量也大大增加了,同时发挥病毒治疗、基因治疗的双重功能。IL-12是一种分泌型糖蛋白,具有广泛的抗肿瘤的作用,它有启动Thl反应的关键细胞因子、激活NK细胞和毒性T淋巴细胞、抑制肿瘤血管生成等功能。为了达到治疗肝癌的目的,本实验构建了内源表达hIL12-p40-LΔP35基因的双靶向溶瘤腺病毒AdCN205-hIL12-p40-LΔ35。CIK细胞(cytokine-induced killer)是外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell,PBMC)细胞经过多种细胞因子(IFN-γ, rIL-2,anti-CD3McAb和IL-1α)共同诱导而获得的一群异质细胞,它同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子,故又被称为NK细胞样T淋巴细胞,兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。作为一种细胞治疗的方法,目前CIK已经广泛的应用于临床。本研究通过体内外实验评估其抗肿瘤效果,观察病毒是否能够特异地在肿瘤中复制,而且是否能高效地表达外源基因,从而更好地发挥病毒基因治疗联合CIK细胞治疗的双重抗肿瘤效果。实验结果显示,CIK细胞联合AdCN205-hIL12-P40-LΔp35具有明显且特异的抗肿瘤能力,安全性良好,在体外和体内都表现出显著的协同抗癌效果。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-6
目录  6-8
缩略语  8-9
1.1 引言  9-16
  1.1.1 溶瘤腺病毒在肿瘤基因治疗中的研究进展  9-12
    1.1.1.1 溶瘤腺病毒  9-10
    1.1.1.2 提高溶瘤腺病毒靶向性的策略  10-12
  1.1.2 CIK在肿瘤基因治疗中的研究进展  12-15
    1.1.2.1 CIK细胞作用机制  13-15
  1.1.3 实验方案设计  15-16
    1.1.3.1 实验目的和意义  15-16
    1.1.3.2 研究内容  16
1.2 实验材料  16-19
  1.2.1 实验材料  16-19
    1.2.1.1 菌株及质粒  16
    1.2.1.2 工具酶及试剂  16
    1.2.1.3 腺病毒  16-17
    1.2.1.4 细胞株  17
    1.2.1.5 实验动物  17
    1.2.1.6 实验所需试剂  17
    1.2.1.7 实验所需要的仪器和设备  17-18
    1.2.1.8 主要溶液的配制  18-19
    1.2.1.9 引物设计与合成  19
1.3 实验方法  19-30
  1.3.1 分子克隆基本方法  19-23
    1.3.1.1 质粒DNA的制备  19-21
    1.3.1.2 从琼脂糖凝胶中回收DNA  21
    1.3.1.3 酶切与连接  21-22
    1.3.1.4 大肠杆菌感受态的制备及转化  22-23
  1.3.2 AdCN205-hIL12-p40-LΔAp35腺病毒载体重组过程  23-26
    1.3.2.1 pCZ203-hIL12-p40-LΔp35的构建  23
    1.3.2.2 pCZ204-hIL12-p40-LΔp35的构建  23-24
    1.3.2.3 在细菌BJ5183中重组得到pCZ205-hIL12-p40-LΔp35  24-26
  1.3.3 病毒的扩增纯化及滴度测定  26-27
  1.3.4 子代病毒复制能力  27
  1.3.5 MTT检测细胞的存活  27-28
  1.3.6 ELISA测定病毒AdCN205-hIL-12表达外源基因  28-29
  1.3.7 AdCN205-GFP荧光表达  29
  1.3.8 荧光化学发光检测细胞存活光表达  29
  1.3.9 SCID鼠Huh7肝癌移植瘤模型的建立及分组治疗  29-30
  1.3.10 ELISA检测组织匀浆中hIL-12的含量  30
1.4 实验结果  30-41
  1.4.1 质粒构建  30-31
    1.4.1.1 pCZ203-hIL.12-p40-LΔp35的构建及鉴定结果  30
    1.4.1.2 pCZ204-hIL12-p40-LΔp35的构建及鉴定结果  30-31
    1.4.1.3 重组得到pCZ205-hIL12-p40-LΔp35及其鉴定结果  31
  1.4.2 病毒包装、扩增  31-32
  1.4.3 病毒包装鉴定结果  32-33
  1.4.4 病毒滴度的测定  33
  1.4.5 AdCN205-hIL-12在体外能够选择性地在肿瘤细胞中复制  33-34
  1.4.6 外源基因选择性地在肿瘤细胞中高量表达  34-36
  1.4.7 AdCN205-hIL-12具有选择性杀死肿瘤细胞的能力  36-37
  1.4.8 AdCN205-hIL-12联合CIK细胞发挥协同作用杀伤癌细胞  37-38
  1.4.9 AdCN205-hIL-12明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长  38-41
结论  41-44
致谢  44-45
参考文献  45-48
硕士阶段发表论文(第一作者)  48

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤治疗学
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