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重组减毒细菌运送CD8～+T细胞表位的机理及携带新城疫病毒DNA 疫苗鼠伤寒沙门氏菌的免疫生物学特性研究

作　者: 潘志明
导　师: 焦新安；Claude Leclerc；刘秀梵
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: CD8~+T细胞表位减毒大肠杆菌减毒鼠伤寒沙门氏菌抗原提呈细胞新城疫病毒融合蛋白 DNA疫苗
分类号: S852.4
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

减毒细菌，包括沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、李斯特菌等，以它们作为疫苗载体可运送表达的外源抗原或DNA疫苗到宿主特定的免疫器官和细胞，激发机体产生保护性的体液免疫、细胞免疫和局部粘膜免疫。但是目前对重组细菌诱导机体针对CD8~+T细胞表位应答的细胞和分子机理还不清楚，这方面的免疫生物学研究，对于理性地设计疫苗，特别是针对胞内病原体引发的疾病以及肿瘤新型基因工程疫苗研制具有重要的意义。为此，本研究以减毒大肠杆菌13A和25A以及减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207为载体，构建了运送卵清白蛋白(OVA)和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)CD8~+T细胞表位的重组细菌，试图阐明重组细菌体外诱导CD8~+T细胞应答的规律。新城疫(ND)是危害养禽业的主要传染病之一。虽然常规疫苗对控制ND的发生和流行起到了非常重要的作用，但也存在难以克服的缺点，如生产成本高、有散毒危险等。为研制一种安全、高效、廉价的新型基因工程粘膜疫苗，本研究对鹅源新城疫病毒(NDV)JS5分离株的F基因进行了克隆、序列分析，在此基础上，构建了运送NDV DNA疫苗的减毒鼠伤寒沙门氏菌，并对其免疫生物学特性作了探讨。 1．重组减毒细菌运送CD8~+T细胞表位的机理研究以脂质体为载体，将真核表达质粒pG2F、pDG2F或pG1B运送到抗原提呈细胞LK~b和LL~d中，经流式细胞术(FACS)检测，质粒携带的绿色荧光蛋白(GFP)基因在细胞中获得了表达。抗原提呈结果显示，OvA257一264和LCMV 1 18一132CDS+T细胞表位基因在抗原提呈细胞(APC)中表达后，可被APC直接加工、提呈给特异性T细胞杂交瘤B3Z和nVIH7，并刺激T细胞杂交瘤分泌产生了IL一2。而且，随着外源基因表达量的增多，其后所获得的抗原提呈效应也相应增强。此结果说明，重组质粒pGZF、pDGZF和pGIB构建正确，即抗原表位基因无论是连接在GFP基因的N末端还是C末端，都能获得成功表达。感染试验证实，减毒大肠杆菌13A和25A以及减毒沙门氏菌sL7207对LKb细胞或LLd细胞均具有良好的侵袭能力;而且骨髓源树突状细胞(BMDC)对重组大肠杆菌具有很好的摄取功能。三种细菌载体均能向LKb或LLd细胞运送真核表达质粒pGZF，并且外源GFP基因获得表达，但是对于不同的细胞类型，细菌的运送效率存在差异。 LKb和LLd细胞对原核表达的cDS+T细胞表位的抗原提呈结果显示，LK”细胞经重组大肠杆菌x3A(ptGZF)和重组沙门氏菌SL7207(ptGZF)、SL7207(pDGZF)感染作用，在感染早期(Zh)，LK“细胞可提呈13A和sL7207表达的ovA257一264cDS+T细胞表位，在感染晚期(48h)，这一提呈效应降低;LLd经重组大肠杆菌13A(ptGZF)感染，在感染早期(Zh)，LLd细胞能提呈13A表达的LeMvl一s一132CDS+T细胞表位，且随着感染时间的推移，提呈效应随之增强。鉴于25A(PtGZF)感染的LK”和LLd细胞均未能有效地刺激相应的T细胞杂交瘤，说明25A没有成功地运送两个T细胞表位。在LK”和LL“细胞对细菌运送的真核表达质粒的抗原提呈试验中发现，重组大肠杆菌13A(pGZF)和25A(pGZF)感染L对细胞Zh，L砂细胞就可将其表达的OVA CDS+T细胞表位提呈给B3ZT细胞杂交瘤，在感染48h时，提呈效应获得温和的增强;经重组沙门氏菌sL7207(pGZF)处理的LKb细胞，在早期(Zh)缺乏刺激相应T细胞杂交瘤的能力，但在晚期(48h)则表现出提呈ovA cDS+T细胞表位的活性。这说明，13A和25A所携带的hly基因有助于真核表达质粒在细胞中的释放和表达。 BMDC对减毒大肠杆菌运送的T细胞表位的抗原提呈结果表明，BMDC经13A(ptGZF)和13A(pGZF)作用后，均能有效提呈OVA257一264和LCMV 118一132CDS+T细胞表位给相应的T细胞杂交瘤，而且在同样的作用条件下，BMDC对13A运送的抗原表位的提呈效应要强于LK”和LLd细胞;由于25A(PtGZF)和25A(pGZF)感染的BMDc未能有效地刺激两种T细胞杂交瘤，说明LPS缺失的25A刺激BMDC成熟的能力不强。2.携带新城疫病毒DNA疫苗鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定以RT一PCR扩增出NDv JSS株融合蛋白(F)基因，将PCR产物克隆入pGEM一Teasy vector，获得重组质粒pGEM一TF。序列测定表明，克隆的F基因全长1 679bp，编码由553个氨基酸组成的前体蛋白F。。在第116一117位氨基酸处，F。被切割成Fl和F:多肤，切割位点的序列为RRQKR 4F，具有强毒株的明显特征。FO中有3个主要由硫水性氨基酸组成的重要功能区，其中F:多肤N端起信号肤作用，介导蛋白质跨膜转位;Fl多肤的N端是起融合作用的主要部位;Fl亚单位的C端为跨膜区。在F。氨基酸序列中，存在6个潜在的糖基化位点和12个半肤氨基酸残基。对F。氨基酸序列同源性比较发现，JSS株与其它鹅源NDV毒株的同源性在97.5%一98.6%之间;与鸡源NDV强毒分离株的同源性在93.1%一98.0%。由于JSS株与上述分离株的F蛋白具有较高的同源性，且主要功能区保守，因此其F基因可以作为构建DNA疫苗的目的基因。将F基因从pGEM一TF中切出，克隆入真核表达质粒pVAXI中，酶切电泳鉴定正确，获得重组表达质粒pVAXI一F。pVAXI一F经脂质体转染cos一7细胞，间接免疫荧光试验检测出F基因在COS一7细胞中的表达产物。通过电穿孔转化法

全文目录

符号说明  14-16
综述一细菌载体技术的研究进展  16-44
  一、减毒细菌疫苗及其表达外源抗原的载体疫苗  16-24
  二、应用减毒细菌运送DNA疫苗  24-33
  三、小结  33
  参考文献  33-44
综述二沙门氏菌感染免疫的研究进展  44-65
  一、沙门氏菌进入宿主和宿主细胞  44-46
  二、沙门氏菌的天然免疫应答  46-50
  三、沙门氏菌获得性免疫应答  50-56
  参考文献  56-65
第一章重组减毒细菌运送CD8~+ T细胞表位的机理研究  65-88
  1 材料与方法  65-72
  2 结果  72-83
  3 讨论  83-86
  参考文献  86-88
第二章携带新城疫病毒DNA疫苗鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定  88-104
  1 材料与方法  89-94
  2 结果  94-99
  3 讨论  99-101
  参考文献  101-104
第三章携带新城疫病毒DNA疫苗鼠伤寒沙门氏菌的免疫生物学特性  104-126
  1 材料与方法  104-107
  2 结果  107-112
  3 讨论  112-115
  参考文献  115-126
结论  126-127
攻读学位期间发表的学术论文目录  127-128
致谢  128

重组减毒细菌运送CD8～+T细胞表位的机理及携带新城疫病毒DNA 疫苗鼠伤寒沙门氏菌的免疫生物学特性研究

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