学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
巨噬细胞特异表达共刺激分子VSIG4抑制T细胞增殖活化
作 者: 李鸣
导 师: 袁发焕
学 校: 第三军医大学
专 业: 内科学
关键词: 巨噬细胞 VSIG4-Fc融合蛋白 VSIG4基因敲除小鼠 T细胞
分类号: R692.5
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
下 载: 21次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
背景和目的肾间质损伤是导致慢性肾功能衰竭的重要原因。肾小管间质损害以肾间质炎细胞浸润为主要特征,其中尤以T细胞浸润和活化最为关键。共刺激分子是调节T细胞活化的一个重要机制。共刺激分子是一类细胞膜表面分子,为T、B细胞的活化提供必需的辅助信号来调节细胞增殖、分化及活化。而缺乏共刺激信号的抗原刺激易引起T细胞应答的无能或调亡。已有研究表明,通过抑制T细胞激活的正性共刺激途径或者增强负性共刺激途径而诱导效应T细胞无能,能够有效减少肾组织损伤。巨噬细胞是肾小管间质浸润中一类非常重要的免疫细胞。巨噬细胞作为专职的抗原递呈细胞(APC),其递呈抗原激活T细胞需要两个条件,一方面,巨噬细胞持续表达MHC分子,为T细胞的激活和功能调节提供了第一信号,不同表型的巨噬细胞表达不同的免疫效应;另一方面,巨噬细胞也表达多种共刺激分子,最终协同调节T细胞的活化。既往的研究表明巨噬细胞可分泌一氧化氮(NO)、金属蛋白酶(metalloproteinases)、细胞因子及生长因子等炎症介质,参与肾间质纤维化的发生发展。最近研究证实,表达IL-4及IL-13的巨噬细胞(M2型巨噬细胞)可减轻阿霉素诱导相关肾炎小鼠的肾小管间质损害,提示巨噬细胞对肾病免疫炎症具有双重调节作用,不仅参与肾脏炎症损伤,同时也可通过表达一些负性免疫调控分子而抑制局部组织免疫炎性反应,从而起到保护作用。由于巨噬细胞具有特异定位于炎性组织的特点,从而可能在局部发挥抗炎修复作用,能避免全身性免疫耐受的发生。那么巨噬细胞是否通过表达负性共刺激分子,诱导间质浸润T细胞的无能,进而减轻肾小管间质的损害呢?这是本研究关注的焦点。VSIG4是新近鉴定的对T细胞活化具有重要调控作用的B7家族共刺激分子,又称补体受体Ig超家族分子(Complement receptor of the immunoglobulin superfamily, CRIg)或Ig超家族蛋白-39 (Ig superfamily protein 39, Z39Ig)。目前发现其主要表达于巨噬细胞。我们前期在慢性肾炎患者监测到肾脏组织浸润巨噬细胞中有VSIG4表达,且表达程度与病变程度呈负相关。之后我们又在动物实验中研究其作用,我们分别在VSIG4基因敲除(VSIG4-/-)小鼠及正常野生型(VSIG+/+)小鼠建立单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral occlusion,UUO)肾病模型,发现VSIG4-/-小鼠术后肾间质炎细胞浸润及小管损伤重程度均显著重于VSIG4+/+组小鼠,同时VSIG4-/-组术后TGF-β1,IL-2、IFN-γ、IL-10的表达水平较VSIG4+/+组均显著增高,表明肾间质巨噬细胞表达VSIG4可通过抑制CD3+、CD4+、CD8+T细胞在肾间质的浸润及其细胞因子效应,进而有效抑制巨噬细胞介导的肾小管间质炎症反应,减轻UUO小鼠肾脏病理变。为了进一步研究巨噬细胞中VSIG4对T细胞效应的抑制作用和机制,本试验在以上体内实验的基础上,进一步进行体外实验研究。首先我们拟制备纯化VSIG4-Fc融合蛋白,并直接刺激T细胞以观察其对T细胞增殖活化的作用;另一方面,我们拟通过获取VSIG4-/-小鼠及VSIG+/+小鼠不同来源的巨噬细胞,并在体外与T细胞分别共培养,通过对比检测各组中T细胞的增殖与活化,来探讨巨噬细胞通过特异表达VSIG4途径抑制T细胞的增殖活化的作用和机制。方法1. VSIG4-Fc的制备:pCEP_m VSIG4_Fc重组质粒(第三军医大学免疫学实验室)测序鉴定。用阳性脂质体Lipofect amineTM2000转染CHO细胞, Western blot检测上清中融合蛋白VSIG4-Fc的表达。经Protein A亲和层析纯化后,SDS-PAGE,免疫印迹鉴定表达产物。2. VSIG4-Fc融合蛋白免疫效应:PMA体外刺激T细胞,分别加入VSIG4-Fc及对照小鼠IgG1,ELISA检测细胞因子IL-2、INF-γ分泌,CCK8法分析细胞的增殖。检测VSIG4-Fc融合蛋白对T细胞增殖活化的调节作用。3. T细胞、VSIG4-/-及VSIG4+/+巨噬细胞的制备:纯化的CD4+T细胞来源于正常小鼠脾脏淋巴细胞悬液,按CD4磁珠分选说明操作。巨噬细胞来自VSIG4基因敲除(VSIG4-/- )及野生型C57B6小鼠腹腔冲洗液。纯化的T细胞与不同类巨噬细胞在CD3单抗刺激下共培养。4. VSIG4-/-巨噬细胞及VSIG4+/+巨噬细胞与T细胞共培养实验分组:1组(空白组):未经CD3刺激的T细胞单独培养。2组(阴性对照组):CD3刺激的T细胞单独培养。3组(VSIG4-/-/T组):VSIG4基因敲除(VSIG4-/- )C57B6小鼠处死后收集腹腔巨噬细胞,收集腹腔冲洗液中巨噬细胞与T细胞在CD3单抗下共培养。4组(VSIG4+/+/T组):野生型C57B6小鼠来源巨噬细胞与T细胞共培养。5.共培养实验中T细胞活化增殖检测:3H-TdR掺入法检测T细胞增殖;流式细胞术检测T细胞活化标志CD69的表达; RT-PCR方法检测各组IL-2、IFN-γmRNA表达水平。ELISA方法检测各组细胞IL-2、IFN-γ蛋白水平的表达。结果1.成功使用阳性脂质体Lipofect amineTM2000转染CHO细胞,并在转染细胞及上清中检测到VSIG4-Fc的融合蛋白表达。转染后蛋白A亲和层析纯化的蛋白产物经Western blot鉴定为VSIG4蛋白。2. VSIG4-Fc融合蛋白对T细胞增殖活化的影响:CCK8检测细胞增殖发现,未加入VSIG4-Fc融合蛋白的对照组中T细胞增殖明显,而加入VSIG4-Fc融合蛋白组OD值与对照组相比显著降低(P<0.05)。流式检测T细胞表面Fas/FasL的表达情况,发现加入VSIG4-Fc融合蛋白后,T细胞表面的凋亡标志Fas/FasL表达明显减少(P<0.05)。ELISA法检测T细胞分泌的细胞因子IL-2、IFN-γ蛋白表达水平,结果显示加入了VSIG4-Fc融合蛋白后,T细胞分泌IL-2、IFN-γ水平明显下降(P<0.05)。提示VSIG4-Fc融合蛋白对T细胞的增殖与活化具有明显的抑制作用。3.VSIG4-/-巨噬细胞及VSIG4+/+巨噬细胞与T细胞共培养:3H-TdR掺入法检测T细胞的增殖,结果显示:VSIG4-/-/T组与VSIG4+/+/T组3H掺入量均显著低于阴性对照组,且VSIG4-/-/T组3H掺入量高于VSIG4+/+/T组,表明VSIG4-/-巨噬细胞对T细胞增殖的抑制力明显减弱。流式检测T细胞表面活化分子CD69,结果显示: VSIG4-/-/T组与VSIG4+/+/T组CD69阳性细胞率与阴性对照组相比较显著降低(p<0.01),且VSIG4-/-/T组CD69阳性细胞率明显高于VSIG4+/+/T组(P<0.01),提示VSIG4-/-巨噬细胞对T细胞活化的抑制能力较VSIG4+/+巨噬细胞减弱。RT-PCR、ELISA法检测IL-2, IFN-γ蛋白及mRNA的表达水平,结果显示:与阴性对照组相比较,VSIG4-/-/T组、VSIG4+/+/T中上述因子表达均显著下降(p<0.01),且VSIG4-/-/T组中IL-2及IFN-γ表达水平均明显高于VSIG4+/+/T组(p<0.01),表明巨噬细胞VSIG4基因敲除后对共培养T细胞活化的抑制减弱,使其活性显著升高。结论1.成功地将VSIG4-Fc-pCI-neo重组质粒转染至CHO细胞,制备了VSIG4-Fc融合蛋白。VSIG4-Fc融合蛋白对T细胞增殖与活化有明显的抑制作用2. VSIG4-/-巨噬细胞对T细胞增殖与活化的抑制能力较VSIG4+/+巨噬细胞明显减弱,提示VSIG4在巨噬细胞抑制T细胞增殖活化的过程中起重要作用。
|
全文目录
主要英文缩写词简表 4-5 英文摘要 5-10 中文摘要 10-13 前言 13-16 第一部分 VSIG4-Fc 融合蛋白对T 细胞活化及增殖的影响 16-34 材料与方法 16-28 结果 28-31 讨论 31-33 小结 33-34 第二部分 巨噬细胞特异表达VSIG4 对T 细胞增殖活化的影响 34-47 材料与方法 34-41 结果 41-44 讨论 44-46 小结 46-47 全文结论 47-48 致谢 48-49 图片 49-55 参考文献 55-58 文献综述 B7 家族新成员- VSIG4 的结构与功能 58-65 参考文献 62-65 攻读硕士期间发表的文章 65
|
相似论文
- 苹果多酚对UVB诱导HepG2细胞损伤的防护与修复研究,S661.1
- 心肌细胞电生理仿真计算引擎自动生成的研究与实现,R319
- 基于细胞电生理模型的膜片钳实验仿真平台设计与实现,R318.0
- 数字电路内建自测试方法的研究,TN79
- 冬凌草甲素调控周期相关蛋白抑制SGC-7901细胞增殖作用的研究,R285
- 不同时间血液灌流对脓毒症兔促炎细胞因子及生存时间影响,R459.7
- 小鼠磨牙中同时过表达sFrp2和sFrp3对磨牙发育的影响,Q954.48
- hBMP4和hBMP7在中国仓鼠卵巢细胞中的表达研究,Q78
- 稻瘟病菌转录因子Moswi6的功能研究,S435.111.4
- 草鱼呼肠孤病毒vp5、vp7基因cDNA的克隆、表达及VP5、VP7蛋白亚细胞定位研究,S941.41
- 猪前脂肪细胞分化过程中抵抗素基因表达水平及其影响因素,R587.1
- Pin1在骨肉瘤细胞中的表达及对细胞周期的影响,R738.1
- 脐血间充质干细胞移植治疗帕金森大鼠的实验研究,R742.5
- 基于电穿孔技术的活细胞表面增强拉曼光谱研究,R318.51
- 西施舌精子冷冻保存及其冷冻损伤机理研究,S968.3
- CADPE抗肿瘤作用及对胃癌细胞凋亡的影响,R735.2
- 沙利度胺衍生物的设计合成及抗肿瘤活性研究,R965
- 塞来昔布与β-榄香烯联合给药的抗肿瘤作用及其机制研究,R96
- 鬼臼毒素衍生物的设计、合成及抗肿瘤活性研究,R284
- 稳定表达人有机阴离子转运多肽OATP1B1野生型及其突变体的HEK-293细胞系的构建,R96
- 一种蛇毒组分对神经细胞的选择性毒性及作用机理的初步研究,Q51
中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 泌尿科学(泌尿生殖系疾病) > 肾疾病 > 肾功能衰竭
© 2012 www.xueweilunwen.com
|