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鸡新城疫病毒的分离鉴定及HN09-68和HN09-83株全基因组的分子特征

作　者: 王泽仁
导　师: 李新生；崔保安
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒 生物学性状 全基因组序列 进化分析
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


新城疫(ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的鸡的高度接触性传染病,是禽类重要的疫病之一。NDV是单股不分节的负链RNA病毒,属于副粘病毒科。全基因组长度约为15kb,分别编码核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶(HN)及聚合酶蛋白(L)等6个主要蛋白。1、按照常规的病毒分离培养、血凝试验(HA)、血凝抑制试验(HI)等实验室诊断技术,对所采集的64份疑似ND病料进行了处理,初步鉴定其中17份病例感染了NDV,ND检出率约为26.6%。初步统计结果表明,不同品种不同日龄的鸡只,ND发病存在一定的差异。经蚀斑纯化分离出NDV HN09-68和HN09-83株,并对其致病指数MDT和ICPI进行了测定,HN09-68的MDT和ICPI值分别为53h和1.75,HN09-83株的MDT和ICPI值分别为59.5h和1.95,由此判定两分离株均为新城疫病毒强毒毒株。2、依据GenBank中公布的新城疫病毒的相关全基因组序列,设计14对特异性引物,运用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增HN09-68和HN09-83两分离株的基因序列,运用DNASTARSeqMan软件进行全基因序列的拼接。经序列分析可知,两株分离株基因组长度均为15192个核苷酸,基因组长度符合“六碱基法则”,两毒株核苷酸同源性为98.6%。基因组5’端长度为55nt,3’端长度为114nt;各基因之间插入1～47nt;两毒株在NP基因非编码区比疫苗株LaSota株长6nt;F蛋白裂解位点推导序列均为“112R-R-Q-K-R-F117”,具备新城疫强毒的分子特征,与其MDT及ICPI毒力指数相符;HN基因ORF均编码571aa,其中347位点由E突变为K;两分离株其各基因在其编码区及非编码区均发生了一定的变异,大多突变属于无义突变。两分离株各基因核苷酸同源性对比发现,两分离株与国内部分NDV强毒分离株亲缘关系较近,而同国外及部分疫苗株同源性较低,说明我国NDV的流行趋于统一,并有着自身的地域特色。

全文目录


致谢  4-8摘要  8-9符号说明  9-10氨基酸的缩写符号  10-11文献综述  11-22  1 NDV 概述  11-13    1.1 新城疫病毒病原学  11    1.2 NDV 宿主范围的演化  11-12    1.3 NDV 抗原的变异  12-13  2 NDV 流行病学研究概况  13-15    2.1 世界ND流行情况  13-14    2.2 中国ND 流行概述  14-15  3 新城疫病毒分子生物学  15-22    3.1 新城疫病毒全基因组  15-16    3.2 NDV 全基因组两端序列  16    3.3 NDV结构基因的分布及其功能  16-22      3.3.1 核衣壳结构蛋白基因  16-17      3.3.2 磷蛋白基因  17-18      3.3.3 基质蛋白基因  18      3.3.4 融合蛋白基因  18-19      3.3.5 血凝素一神经氨酸酶基因  19-21      3.3.6 大分子蛋白基因  21-22第一部分 河南部分地区 NDV 的分离与鉴定  22-29  1 材料  22-23    1.1 病料  22    1.2 参考毒株和标准血清  22    1.3 SPF 鸡胚及SPF 雏鸡  22    1.4 主要试剂  22    1.5 主要仪器设备  22    1.6 试剂的配制  22-23  2 方法  23-25    2.1 病料处理  23    2.2 血凝试验(HA)及血凝抑制试验(HI)  23-24    2.3 病毒纯化  24    2.4 MDT(最小致死量引起所有鸡胚死亡的平均时间)测定  24-25    2.5 ICPI(1 日龄 SPF 鸡脑内接种分离病毒致病指数)测定  25  3 结果  25-27    3.1 病毒分离  25-26    3.2 病毒纯化结果  26    3.3 病毒毒力的测定结果  26-27  4 讨论  27-29第二部分 HN09-68和HN09-83株全基因组序列 的测定及其分子特征  29-69  1 材料  29-30    1.1 病毒  29    1.2 主要试剂  29    1.3 主要仪器设备  29    1.4 试剂的配制  29-30  2 方法  30-36    2.1 引物设计  30-32    2.2 病毒RNA 的提取  32    2.3 目的基因的RT-PCR 扩增  32-33      2.3.1 两步法反转录（RT）  32      2.3.2 PCR 扩增  32-33    2.4 NDV 各基因片段的克隆  33-36      2.4.1 DH5α 感受态细胞的制备  33      2.4.2 PCR 产物的回收纯化  33-34      2.4.3 PCR 产物的连接  34      2.4.4 连接产物的转化  34      2.4.5 挑斑  34      2.4.6 质粒提取  34-35      2.4.7 目的基因的克隆鉴定  35      2.4.8 各基因序列分析  35-36  3 结果与分析  36-65    3.1 全基因PCR扩增各基因片段纯化回收产物琼脂糖凝胶电泳图  36    3.2 全基因PCR扩增各基因片段酶切产物琼脂糖凝胶电泳图  36-37    3.3 全基因组序列分析  37-65      3.3.1 NDV 5’端核苷酸序列对比分析  38-39      3.3.2 NDV 3’端核苷酸序列对比分析  39-40      3.3.3 NDV F 基因全序列对比分析  40-46      3.3.4 NDV NP 全基因对比分析  46-49      3.3.5 NDV P 全基因对比分析  49-52      3.3.6 NDV M 全基因对比分析  52-54      3.3.7 NDV HN 全基因对比分析  54-57      3.3.8 NDV L 全基因对比分析  57-65  4 讨论  65-69参考文献  69-75英文摘要  75-77硕士期间主要发表论文  77

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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