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牛结核病三价DNA疫苗制备工艺研究及免疫效果初步评价

作 者: 宋振忠
导 师: 黄炯;冉多良;呼西旦
学 校: 新疆农业大学
专 业: 预防兽医学
关键词: DNA疫苗 半合成培养基 发酵工艺 纯化 免疫效果
分类号: S858.23
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


本研究在《牛结核杆菌多价DNA疫苗的田间实验和生物安全性研究》项目(国家863项目)的基础上,对用于牛结核病三价DNA疫苗的工程菌进行了中试生产工艺的研究,并对用于牛结核病DNA疫苗质粒DNA进行了小试规模的纯化;最后以该工艺生产的疫苗免疫小鼠和本动物牛,初步评价所生产的DNA疫苗的免疫效果。首先,在实验室条件下用摇瓶试验对含有重组真核表达质粒pjw4303-mpt83、pjw4303-mpt64、pjw4303-Ag85b的大肠杆菌DH5a工程菌进行了小规模的研究,用三种不同的培养基对其进行培养,筛选出具有高密度发酵潜力的半合成培养基作为中试规模的生物反应器培养基,并针对该培养基进行质粒的稳定性测试。采用NBS110型号的14 L发酵罐,在分批培养、指数流加补料,37℃-42℃的改变、dO2控制在45%左右、pH值控制在7.0、转速控制在200 rpm-600 rpm之间的条件下,用半合成培养基所培养的工程菌密度OD600为22.92,湿重为27.173g/L,质粒产量为1.44mg/g湿菌。该工艺大大节约了生产疫苗的成本,并为牛结核杆菌DNA疫苗工程菌的大规模生产奠定基础。其次,在高密度发酵工程菌的基础上,通过传统的碱裂解,获得粗提的质粒。用氯化钙去除裂解液中的大部分RNA,并用Sartobran P囊式过滤器获得了澄清的溶液;用聚乙二醇法沉淀超螺旋质粒DNA,去除大部菌体蛋白和宿主DNA;再用source 30Q阴离子交换色谱使、DNA疫苗中的内毒素的含量由过柱前的0.09~0.15降到过柱后的<0.0197,说明阴离子交换色谱可以显著的降低内毒素的含量,纯化后的DNA疫苗经纯度检验A260/280在1.84-1.88之间,蛋白质达到测不出的水平。说明该工艺纯化的DNA疫苗达到了动物免疫试验的要求。该工艺实现了一步色谱纯化DNA疫苗的目的,具有简单、快速的优点。最后,为检验纯化后的疫苗免疫效果,分别对小鼠和牛进行免疫。在小鼠的体液免疫抗体滴度测定中:免疫后3周部分组小鼠的抗体滴度分别从第一次免疫后的1:200达到第三次免疫后的1:12800,说明DNA疫苗能够强烈的引起小鼠的体液免疫反应;在小鼠的细胞免疫IFN-γ的测定中,特异性IFN-γ含量分别是:Ag85B,234.19±69.88;MPT64,115.62±55.38; MPT83,179.61±66.26,免疫组分别是PBS组和空载体组的7-15倍;测得牛的体液免疫抗体滴度结果表明:三免后1个月的数据最高可达到1:3200。表明,DNA疫苗能够引起小鼠和牛的特异性免疫反应,但确实的免疫效果评价还需要正在进行的攻毒试验数据来评价。但本研究中所设计的制备工艺与商品化的试剂盒所纯化出的DNA疫苗免疫后的数据差异并不是很显著可以说明,本研究所设计的制备DNA疫苗的工艺不会引起DNA疫苗免疫后效果的显著改变,说明本文所设计的制备工艺合理、有效。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-9
第1章 牛结核病研究进展  9-19
  1.1 病原  9-10
  1.2 流行病学  10-11
  1.3 致病机理  11
  1.4 临床症状  11-12
  1.5 牛结核杆菌的主要抗原  12-13
  1.6 诊断方法  13-16
  1.7 预防  16-17
  1.8 展望  17-19
第2章 DNA疫苗的生产工艺研究进展  19-32
  2.1 核酸疫苗  19
  2.2 DNA疫苗的优点  19-20
  2.3 DNA疫苗的免疫原理  20
  2.4 DNA疫苗佐剂  20-21
  2.5 DNA疫苗的安全性  21-22
  2.6 DNA疫苗的生产研究进展  22-27
  2.7 展望  27-29
  本论文的研究背景  29-31
  本论文的研究目的  31-32
第3章 牛结核杆菌DNA疫苗工程菌的高密度培养研究  32-43
  3.1 材料  32-33
  3.2 方法  33-36
  3.3 结果  36-40
  3.4 讨论  40-43
第4章 用于牛结核病DNA疫苗质粒DNA的纯化及质量鉴定  43-53
  4.1 材料  43
  4.2 方法  43-46
  4.3 结果  46-51
  4.4 讨论  51-53
第5章 牛结核病三价DNA疫苗的免疫效果评价  53-62
  5.1 材料  53-54
  5.2 方法  54-57
  5.3 结果  57-60
  5.4 讨论  60-62
第6章 结论  62-63
参考文献  63-69
附录  69-70
致谢  70-71
作者简介  71

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