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鸡新城疫病毒地方流行株的分离鉴定及免疫程序的试验研究

作　者: 吕丽萍
导　师: 韦平
学　校: 广西大学
专　业: 禽病与病原分子生物学
关键词: 新城疫病毒 分离鉴定 强弱毒鉴定 F基因 序列分析 免疫程序 攻毒保护率
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的接触性、高度致死性的传染病。自1926年确认以来,曾经是威胁世界养禽业的重大疾病,随着疫苗的广泛应用,近年来鲜见大规模暴发新城疫的报道,但出现了多次免疫或者高抗体水平下仍然鸡发病的情况。因此,对当前的现场流行株进行分离鉴定、强弱毒鉴别、序列分析及基因型分类等的研究,将有助于持续跟踪毒株的变异规律。另外,根据毒株的变异情况合理选用疫苗及修订免疫程序,对完善ND的防控方案具有价值的参考。首先,本课题无菌采集广西各地疑似NDV感染鸡群病死鸡的病料并接种于10d龄的SPF鸡胚尿囊腔,观察鸡胚病变情况。尿囊液无菌检验后进行血凝试验(HA),然后使用NDV阳性血清进行血凝抑制试验(HI),并采用RT-PCR进行NDV的快速鉴定。结果表明,有11份病料接种的鸡胚尿液均有血凝价,且能被NDV的阳性血清所抑制,不能被禽流感的阳性血清抑制；RT-PCR的结果均能扩增出一条约362bp的NDV特异性目的条带,由此可判定成功地分离到11株NDV。用经典的毒力判断方法即鸡胚平均致死时间(MDT)及1日龄脑内接种致病指数(ICPI)对分离到的11株NDV分离株分别进行毒力测定。结果表明GXY0803、GXY0903和GXY0904三个分离株为弱毒株,GXN070S9、GXN0710、GXN0711、GXN0712、GXN0713、GXG1003、GXG1004、GXY1011八个分离株为强毒株,结果与本实验室建立的应用PT-PCR鉴定NDV强弱毒方法的结果相一致。然后,对11个NDV分离株F基因分别进行克隆及测序。结果表明,强毒株GXN0710、GXN0711、GXN0712、GXN0713、GXN0709、GXG1003、GXG1004和GXY1011在F蛋白裂解位点的序列均为112R/K-R-Q-K/R-R-F117,符合强毒株的特征,毒株间的核苷酸同源性为95.5-99.9%,与GenBank上发表的NDV基因Ⅶ型的参考株DQ485260和GXC1的同源性为94.1%-96.9%,而与弱毒疫苗株LaSota的同源性仅为83.4-84.9%,在系谱进行化树上同属基因Ⅶd亚型；而弱毒株GXY0803、GXY0903和GXY0904在F蛋白裂解位点的序列均为112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117,符合弱毒株的特征,3个毒株间核苷酸同源性为99.7-99.9%,与弱毒疫苗株Clone30和LaSota的同源性为99.7-99.9%,而与基因Ⅶ型强毒株DQ485260和GXC1的同源性仅为84.6-84.9%,在系谱进行化树上属于基因Ⅱ型。最后,根据本地具体情况本课题分别设计了两组免疫程序,其中试验一：A1组为临床上大公司常用的免疫程序即5d龄使用ND+IB活苗1羽份进行滴眼,10d龄用ND+IB活苗1羽份进行滴眼,同时ND油苗0.4羽份颈部皮下注射,20d龄用NDⅠ系2羽份肌肉注射及ND油苗0.4羽份颈部皮下注射,A2组对比A1组5d龄使用ND+IB活苗2羽份分别进行滴眼滴鼻,A3组与A4组在5d龄加上梅里亚的ND油苗(高力优)0.66羽份,观察早期的保护率差异,A4组在20d龄取消NDⅠ系的注射,A12组为对照组,不免疫任何ND疫苗；试验二：B1组为临床上大公司常用的免疫程序,与试验一的A1组一样,B3组比较B1组在5d龄使用ND+IB活苗2羽份分别进行滴眼滴鼻同时取消20d龄NDⅠ系的注射,B5组与B7组在5d龄加上自家ND油苗1羽份,观察早期的保护率差异,B7组在20d龄取消ND I系的注射,B9组为对照组,不免疫任何ND疫苗。所有试验鸡分别在5d龄、14d龄、21 d龄、28d龄、35d龄、42d龄、49d龄、56d龄、63d龄、70d龄(试验二为66d龄)采取鸡的血清并测定其HI抗体和ELISA抗体,并在14d龄、28d龄、42d龄、56d龄(试验二为14d龄、28d龄、35d龄、66d龄)分别用参考强毒株F48E9和地方分离强毒株GXC1进行攻毒。试验结果表明,未免疫ND疫苗的对照组抗体水平从14d龄开始逐渐下降,至35d龄后趋势于0,各攻毒天龄段的攻毒保护率均为0,而免疫组经过弱毒疫苗(2次)结合灭活疫苗(2次)的免疫程序无论5d龄免疫1羽份或2羽分ND+IB活苗,5d龄是否免疫油苗,20d龄是否免疫NDⅠ系,抗体水平变化规律相似,攻毒保护率相似,14d龄时的攻毒保护率绝大部分在80%以上,28d龄之后的攻毒保护率均为100%。本课题研究的结果表明,近年本地流行的NDV强毒株均属于F基因的Ⅶ型d亚型,实验室建立针对病毒核酸的PT-PCR鉴定强弱毒的方法具有简便快速、准确、成本低的优势,而且避免了使用活病毒操作可能带来的污染的危险。不同免疫程序的比较试验证明,弱毒疫苗(2次)结合灭活疫苗(2次)的程序,对于70d龄前上市的肉鸡而言完全可以保护强毒株的攻击,具有安全、免疫应激小的优势,可在本地的实际养鸡生产中推广应用。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
目录  10-12
前言  12-14
第一章 新城疫病毒的基因变异及不同疫苗免疫效果的研究  14-25
  1.1 新城疫及其病毒的基本情况  14-15
    1.1.1 新城疫的流行情况  14-15
    1.1.2 新城疫病毒的分类情况  15
  1.2 新城疫病毒基因变异的研究进展  15-18
    1.2.1 新城疫病毒的基因组结构  15-16
    1.2.2 基因分型研究进展  16-18
  1.3 新城疫病毒的诊断方法  18-20
    1.3.1 血清学诊断方法  18-19
    1.3.2 分子生物学诊断方法  19-20
  1.4 临床疫苗免疫效果的研究  20-24
    1.4.1 活苗与灭活苗的特点  20
    1.4.2 新城疫疫苗的种类及效果  20-21
    1.4.3 新城疫免疫力的产生  21
    1.4.4 新城疫抗体水平的检测  21
    1.4.5 新城疫疫苗的免疫效果研究进展  21-23
    1.4.6 新城疫免疫失败原因分析  23-24
  1.5 开展本课题研究的主要内容及其意义  24-25
第二章 新城疫病毒地方株的分离鉴定  25-34
  2.1. 材料  25-26
    2.1.1 病料及来源  25-26
    2.1.2 试验的鸡胚及雏鸡  26
    2.1.3 鸡的红血球  26
    2.1.4 试剂  26
    2.1.5 引物设计  26
  2.2 方法  26-27
    2.2.1 病毒分离  26-27
    2.2.2 鸡胚尿囊液的血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验  27
    2.2.3 毒株的RT-PCR验证  27
    2.2.4 毒株的毒力测定  27
  2.3 结果  27-32
    2.3.1 死亡鸡胚的细菌检查结果和胚体的变化  27-28
    2.3.2 HA与HI试验结果  28
    2.3.3 RT-PCR特异性验证结果  28
    2.3.4 毒株的MDT数值  28-30
    2.3.5 毒株的ICPI数值  30-31
    2.3.6 各毒株RT-PCR强弱毒快速鉴定结果  31-32
  2.4 小结与讨论  32-34
第三章 新城疫病毒分离株F基因序列的测定与分析  34-42
  3.1 材料  34-35
    3.1.1 毒株  34
    3.1.2 试剂  34
    3.1.3 引物设计与合成  34-35
    3.1.4 分子生物学分析软件  35
  3.2 方法  35
    3.2.1 病毒RNA的提取  35
    3.2.2 cDNA的合成及F基因的PCR扩增  35
    3.2.3 毒株PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果分析  35
    3.2.4 毒株PCR扩增产物纯化、克隆与测序  35
    3.2.5 毒株F基因序列的分析  35
  3.3 结果  35-40
    3.3.1 分离株F基因的扩增结果  35-36
    3.3.2 分离株F基因与其它参考毒株的核苷酸同源性比较及系谱进化树分析  36-37
    3.3.3 分离株F基因的核苷酸与其它参考毒株的同源性比较  37-40
  3.4 小结与讨论  40-42
第四章 不同疫苗及其免疫程序效果的试验研究  42-59
  4.1 材料  42-43
    4.1.1 鸡胚  42
    4.1.2 试验鸡  42
    4.1.3 试剂  42
    4.1.4 场地  42-43
    4.1.5 疫苗  43
  4.2 方法  43-45
    4.2.1 免疫程序设计  43-44
    4.2.2 ND自家油苗制备  44-45
    4.2.3 预试验  45
    4.2.4 血清样品的采集及保存  45
    4.2.5 抗体水平监测  45
    4.2.6 攻毒试验  45
  4.3 结果  45-56
    4.3.1 预试验结果  45-46
    4.3.2 抗体水平监测结果  46-54
    4.3.3 攻毒保护试验结果  54-56
  4.4 小结与讨论  56-59
第五章 结论  59-60
参考文献  60-64
致谢  64-65
个人简历  65
攻读硕士学位期间参与的科研项目及论文发表情况  65

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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