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猪源链球菌类M蛋白基因的克隆、序列分析、表达及动物免疫试验

作　者: 范红结
导　师: 唐家琪；陆承平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 马链球菌兽疫亚种猪链球菌2型类M蛋白基因溶菌酶释放蛋白基因克隆融合表达序列分析
分类号: S852.4
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)和猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)是重要的人兽共患病的病原，能引起猪和人类的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎以及突发性死亡，对养猪业造成巨大的经济损失。马链球菌兽疫亚种表面的类M蛋白(M-like protein)和猪链球菌2型表面的溶菌酶释放蛋白(Muramidase released protein,MRP)是重要的毒力因子和保护性抗原。本文在分子水平对以上毒力因子进行了较系统的研究，并将二者进行了串连表达及猪体免疫试验，为猪链球菌病的防制进行了有益的探索。 1 马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因克隆，序列分析及猪源链球菌类M蛋白基因检测根据已发表的马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus)的类M蛋白基因序列，设计和合成一对引物，以猪源马链球菌兽疫亚种ATCC35246株的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增出类M蛋白基因并定向克隆至表达载体pET-32a(+)中，测定其序列，在GenBank登录，接收号为AY263781。类M蛋白基因含一个完整的开放阅读框，全长为1137bp，编码379个氨基酸残基。经DNA Star软件分析，ATCC35246株类M蛋白基因与马源兽疫亚种W60株、马亚种的类M蛋白基因及A群化脓链球菌的M蛋白基因的同源性分别为86.9％、30.8％、29.4％；推导的氨基酸序列的同源性分别为84.3％、21.9％、23.4％。但ATCC35246株类M蛋白的C末端细胞膜锚定区与M蛋白、马亚种类M蛋白高度同源。用上述设计的引物进行PCR试验，检测34株猪源链球菌类M蛋白基因，发现所有C群猪源链球菌均能检测出类M蛋白基因，而所有猪链球菌(Streptococcus suis)1型和2型菌株及B群、D群链球菌均不能检出类M蛋白基因。本研究首次克隆了猪源马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因，并对该基因进行了序列分析，证实马链球菌兽疫亚种猪源株与马源株有较大差异。 2 猪源马链球菌兽疫亚种9株中国株类M蛋白基因的克隆与序列分析利用PCR技术，分别扩增国内9省市从1974～2003年分离的马链球菌兽疫亚种类的M蛋白基因，对其进行克隆、测序及序列分析，进而推导其相应的氨基酸序列。结果发现，9分离株中的7株类M蛋白基因片段长度为1 137bp，含一个阅读框，编猪源链球菌类M基因的克隆、序列分析、表达及动物免疫试验码379个氨基酸残基，另外两株eG一74一63和Cp一。一04的长度分别为1 143bp及1125bp。除CP一0104分离株外，8株菌的类M基因的核普酸同源性高达%.9%一99.9%，推导的相应氨基酸序歹，】同源性高达95.30，0一x00o，o。上述测定的ATCC35246、CC、CxyolZ、SH0016、CY分离株类M基因序歹.J已被GenBank收录，登录号分别为AY263781、AY263782、 AY263783、AY263784、AY265990.上述9株猪源株与国外发表的马源马链球菌兽疫亚种W60株类M基因的核普酸同源性达81.6%一87.0%，推导的相应氛基酸序列同源性为78.1%一84.3%;猪源株与人源马链球菌兽疫亚种类M基因的核普酸同源性为81 .7%~91.8%，推导的相应氨基酸序列同源性为76.0%一90.5%. 9株分离株除CP一0104株外，信号肤的序列完全一致，与马源马链球菌兽疚亚种W60株类M蛋白的信号肤相比，其27、28、30、32位的氨基酸残基分别由S、S、V、A突变为G、v、A、5.在类M蛋白的C末端，9株分离株的细胞锚定区的序列亦完全一致，均含有LPSTGE共同的基序.在类M蛋白的高变区，通过比较9株兽疫亚种分离株推导的类M蛋白的氨基酸序歹，l发现，Al，CC35246、CC、CY、SH0016、CT、CG一74一63等6株分离株类M蛋白高变区的氨基酸完全一致，其余3株分离株有较小的差异.其中，CXY012株109位氨基酸残基由L突变为F，143位氨基酸残基由A突变为E，157位由K突变为E。CW03株第113、116位氨基酸残基由I、K突变为F、E，第121、127、137、139、140等处由E、Q、R、D、A突变为K、P、H、T、T.CP一0104与其它猪源链球菌高变区的变异更大，在106、107、111、116、118、121、122、123等 28处的氨基酸发生T突变，且在126-128、140一146位分别缺失了3个和6个氛基酸残基。酶切位点分析显示，9株分离株均在524ni处出现Hindln酶切位点，而人源和马源分离株均没有该酶切位点. 本结果研究表明马链球菌兽疫亚种类M蛋白具有宿主特异性，与马源、人源兽疫亚种分离株类M蛋白的差异主要在106一1“位氛基酸的高变区及27一32位氨基酸残基的信号肤。3马链球菌兽疫亚种10株国内分离株对小鼠免疫效力的评价取国内10省市分离的10株猪源马链球菌兽疫亚种，分别制备灭活杭原，免疫清洁级ICR小鼠。小鼠分20组，每组10只，分别用以上10株菌免疫，然后用同源菌株和ATCC35246株攻击。结果表明，同源菌株攻击，免疫保护率均在90%以上;而以ATCC35246攻击异源菌免疫的小鼠，免疫保护率为80%一100%.本研究结果表明，我国不同地区的猪源马链球菌兽疫亚种分离株的杭原性差异不大，单一菌株疫苗可用于不同地区的猪群。中文摘要4猪链球菌2型mrP基因免疫功能片段的克隆、表达及动物试验根据猪链球菌2型(StrePcococcus suis

全文目录

摘要  5-8
ABSTRACT  8-13
前言  13-14
文献综述  14-51
  第一章猪链球菌2型及猪链球菌病  14-30
    1 病原学  15
    2 流行病学  15-16
    3 临床症状及病理变化  16-18
    4 致病机理  18-19
    5 猪链球菌病的诊断  19-22
    6 猪链球菌病的防制  22-25
    参考文献  25-30
  第二章马链球菌兽疫亚种及其毒力因子  30-51
    1 病原学  30-31
    2 流行病学  31
    3 毒力因子  31-41
    4 马链球菌兽疫亚种逃避宿主免疫的可能机制  41-44
    参考文献  44-51
研究报告  51-124
  第一章马链球菌兽疫亚种ATCC35246株类M蛋白基因克隆、序列分析及猪源链球菌类M蛋白基因检测  51-74
    摘要  51
    1 材料与方法  51-56
    2 结果  56-60
    3 讨论  60-62
    参考文献  62-74
  第二章猪源马链球菌兽疫亚种9株中国株类M基因的克隆与序列分析  74-91
    摘要  74-75
    1 材料与方法  75-76
    2 结果  76-81
    3 讨论  81-84
    参考文献  84-91
  第三章马链球菌兽疫亚种10株国内分离株对小鼠免疫效力的评价  91-99
    摘要  91
    1 材料与方法  91-93
    2 结果  93-96
    3 讨论  96-97
    参考文献  97-99
  第四章猪链球菌2型mrp基因免疫功能片段的克隆、表达及动物试验  99-108
    摘要  99
    1 材料与方法  99-101
    2 结果  101-103
    3 讨论  103-106
    参考文献  106-108
  第五章链球菌2型mrp基因片段与马链球菌兽疫亚种类M基因片段的融合表达及猪体免疫  108-124
    摘要  108
    1 材料与方法  108-112
    2 结果  112-118
    3 讨论  118-122
    参考文献  122-124
全文总结  124-125
致谢  125-126

猪源链球菌类M蛋白基因的克隆、序列分析、表达及动物免疫试验

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