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马链球菌兽疫亚种全菌结合类M蛋白亚单位灭活疫苗的研制

作　者: 袁娟
导　师: 何孔旺；费荣梅
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 马链球菌兽疫亚种类M蛋白基因融合表达免疫保护
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 4次
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内容摘要

马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi Subsp.zooepidemicus, SEZ)是引发猪链球菌病的主要病原之一,主要引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、肺炎、及突发性死亡。其引起的动物疫病呈世界性分布,是目前危害我国猪群最严重的细菌性传染病之一。马链球菌兽疫亚种的类M蛋白(M-like protein, SzP)是一种重要的表面蛋白和毒力因子,具有调理素功能,且能够抵抗抗体的吞噬细胞对其的吞噬作用。本实验对具有免疫原性的类M蛋白进行原核表达,以期制造出可以对马链球菌兽疫亚种引致的猪链球菌病进行有效预防的疫苗。根据已经发表的马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi Subsp.zooepidemicus)猪源菌株的类M蛋白序列设计合成一对引物,以CY株基因组为模板,通过PCR技术,扩增类M蛋白基因并定向克隆于pMD-18T载体中,鉴定阳性质粒插入片段的正确性,将目的基因片段定向克隆至pGEX-4T-1表达载体的BamH I和Xho I位点之间。重组质粒经限制性酶切鉴定和测序,以验证其阅读框架的正确性。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,可获得分子量约为64kD的融合蛋白。通过和类M蛋白的多克隆抗体免疫印迹分析表明,表达的融合蛋白同时具有类M蛋白的抗原性。以不同含量的融合蛋白加入马链球菌兽疫亚种全菌灭活疫苗分别免疫仔猪5头,同时以马链球菌兽疫亚种全菌灭活疫苗免疫对照组仔猪,免疫后21d用2倍MLD的CY菌(105CFU)进行攻毒,结果显示所制混合疫苗的免疫保护率优于全菌灭活苗；且联合疫苗的最小免疫剂量可为重组蛋白(0.125mg)+CY(8×108CFU)。

全文目录

中文摘要 6-7ABSTRACT 7-9前言 9-11第一篇文献综述 11-33 第一章马链球菌兽疫亚种的研究进展 11-26 1 病原学 11-12 2 流行病学 12 3 临床症状与病理变化 12-13 4 毒力因子 13-20 4.1 类M蛋白 13-16 4.2 链激酶 16-17 4.3 金属结合脂蛋白 17 4.4 IgG结合蛋白 17-19 4.5 纤维结合素结合蛋白 19-20 4.6 透明质酸荚膜 20 5 马链球菌兽疫亚种逃避宿主免疫的可能机制 20-23 5.1 通过类M蛋白N末端电荷的排斥作用 21 5.2 通过类M蛋白N末端的变异 21-22 5.3 通过结合H因子逃避免疫 22 5.4 借助IgG结合蛋白逃避免疫 22 5.5 菌体荚膜的抗吞噬作用 22-23 6 猪链球菌病疫苗的研究进展 23-26 6.1 活疫苗 23 6.2 灭活菌苗 23-24 6.3 基因工程疫苗 24-26 参考文献 26-33第二篇研究报告 33-59 第一章马链球菌兽疫亚种CY株类M蛋白的克隆与原核表达 33-49 1 材料和方法 34-42 1.1 菌种、宿主菌和质粒 34 1.2 酶和试剂 34 1.3 PCR 34-36 1.4 类M蛋白基因的克隆 36-38 1.5 重组质粒鉴定 38-39 1.6 重组表达载体的构建及鉴定 39 1.7 重组蛋白的诱导表达 39-40 1.8 重组蛋白的纯化 40-41 1.9 免疫转印 41-42 2 结果 42-45 2.1 PCR扩增结果 42-43 2.2 重组表达质粒的构建及鉴定 43 2.3 重组质粒的序列测定 43-44 2.4 类M基因在BL21中的表达 44 2.5 重组蛋白的免疫反应原性鉴定 44-45 3 讨论 45-47 参考文献 47-49 第二章联合疫苗的制备及动物试验 49-59 1 材料和方法 49-51 1.1 菌株和质粒 49 1.2 实验动物 49-50 1.3 重组质粒在大肠杆菌中的表达 50 1.4 马链球菌兽疫亚种全菌灭活菌的制备 50 1.5 联合免疫原的制备 50 1.6 联合疫苗对ICR小鼠的保护性试验 50-51 1.7 联合疫苗的仔猪保护性试验 51 2 结果 51-54 2.1 ICR小鼠分组及免疫保护结果 51-52 2.2 重组蛋白最小免疫剂量的确定试验 52-53 2.3 CY株最适含菌量的确定试验 53-54 3 讨论 54-56 参考文献 56-59全文总结 59-61附录 61-65致谢 65

马链球菌兽疫亚种全菌结合类M蛋白亚单位灭活疫苗的研制

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