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柔红霉素C-14羟化酶基因的克隆、表达和应用研究

作　者: 吴大治
导　师: 朱宝泉；朱春宝
学　校: 上海医药工业研究院
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 柔红霉素阿霉素柔红霉素C-14羟化酶基因天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI 1482 变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24 克隆表达微生物转化
分类号: TQ465
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

柔红霉素和阿霉素是临床上重要的蒽环类抗生素，主要用于多种实体瘤和急性白血病的治疗，在临床上作为一线抗肿瘤药物使用。阿霉素是柔红霉素C-14位羟化的衍生产物，具有比柔红霉素更广的抗肿瘤谱和更小的毒副作用。目前工业上采用化学半合成法从柔红霉素转化生产阿霉素，不仅工艺复杂、转化率低，而且污染环境严重。本研究对微生物转化法替代现有工艺生产阿霉素进行了探索，从柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌SIPI 1482中克隆了柔红霉素C-14羟化酶基因(doxA)，构建了doxA基因的链霉菌表达质粒，导入变铅青链霉菌TK24中获得了柔红霉素转化基因工程菌，并研究了doxA基因在工程菌中的表达，最后还对工程菌转化柔红霉素生成阿霉素的发酵工艺进行了初步研究。研究结果如下：通过PCR方法，首次从天蓝淡红链霉菌SIPI 1482菌株基因组DNA中扩增出约1.4 kb大小的doxA基因片段，这在国内外还是首次报道；但是从波赛链霉菌SIPI 40141菌株中却没有扩增出任何片段。经过测序和序列比对分析，PCR扩增获得的doxA基因序列和链霉菌C5菌株来源doxA基因序列完全相同，而和公开发表的波赛链霉菌ATCC 29050来源doxA基因同源性为93.4％。构建了一个新颖的链霉菌高拷贝表达载体质粒pYG504，以用于异源基因在链霉菌中的克隆和表达。该载体质粒采用了黑色素基因(编码酪氨酸酶)启动子(Pmel)和fd终止子，启动子下游的SphⅠ、BglⅡ、SacⅠ、XbaⅠ和HindⅢ单一酶切位点可以用于插入异源目的基因，并且在SphⅠ位点上游存在SD序列。构建了五个doxA基因链霉菌表达质粒pYG57、pYG502、pYG503、pYG505和pYG506，使得doxA基因在上游的Pmel启动子、红霉素抗性基因启动子(PermE)或者两者的串联启动子，以及下游的fd终止子(fd terminator)控制之下。相应地将构建的表达质粒导入变铅青链霉菌TK24中获得五株基因工程菌株。 SDS-PAGE蛋白电泳实验证明，上述五个菌株都能够表达大小约45 kD的柔红霉素C-14羟化酶蛋白，并发现以在PermE启动子控制下的doxA基因表达量相对较高，而终止子对＠中英文摘要 dd基因表达似乎没有影响。而对Tm4（pYG57）菌株中doxA基因表达方式的研究表明， dd基因在 PermE启动子控制下可能是一种组成型控制表达，其表达量在接种后培养到 48－60 h左右最高并且维持相对稳定，并且表达的柔红霉素 Cl4羟化酶主要存在于菌丝体细胞内，很少分泌到细胞外。对所构建的doxA基因工程菌发酵转化柔红霉素的实验结果表明，它们都能将桑红霉素转化为阿霉素和某一副产物组分，并且以 TK24（pYG505）菌株转化桑红霉素生成阿霉素的能力相对较强。通过桑红霉素转化产物的紫外可见吸收光谱分析、LC／MS分析和‘H－NMR＠分析，最终确定工程菌的柔红霉素转化产物中主要由阿霉素和13－M氢柔红霉素组成．其中前者由工程菌细胞内的羟化酶转化细胞中的柔红霉素形成。后者由宿主菌本身C1 酮还原酶转化桑红霉素形成。对TK24（pYG57）工程菌株转化柔红霉素条件进行了初步优化，在优化树下工程菌 TK24巾YG57）对桑红霉素的转化率为 74．4％，是优化前的 3．l倍；而阿霉素和 13－一氢桑红霉素之比从0．N提高到o．叩。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
缩写  7-11
1 绪论  11-33
  1.1 重要的蒽环类抗生素--柔红霉素和阿霉素简介  11-14
    1.1.1 柔红霉素和阿霉素的分子结构  11-12
    1.1.2 柔红霉素和阿霉素的作用机制  12-13
    1.1.3 柔红霉素和阿霉素的工业生产方法  13-14
  1.2 柔红霉素和阿霉素的生物合成  14-21
    1.2.1 生物合成途径的研究方法  14-15
    1.2.2 生物合成途径  15-18
    1.2.3 生物合成基因及其分子生物学研究  18-21
  1.3 链霉菌基因表达系统  21-27
    1.3.1 变铅青链霉菌作为基因工程宿主菌的优点  21
    1.3.2 链霉菌基因克隆的载体系统  21-23
    1.3.3 链霉菌基因的启动子  23-24
    1.3.4 链霉菌基因的转录终止子  24
    1.3.5 链霉菌基因的密码子偏向性和SD序列  24-25
    1.3.6 影响链霉菌基因表达的其它因素  25-26
    1.3.7 异源基因在链霉菌中的表达  26-27
  1.4 微生物转化  27-31
    1.4.1 微生物转化的特点  27-28
    1.4.2 微生物转化的应用  28-29
    1.4.3 微生物转化技术的研究前沿  29-31
  1.5 本课题的立题意义和研究内容  31-33
2 doxA基因的克隆  33-54
  2.1 实验材料  34-38
    2.2.1 菌种和质粒  34-35
    2.2.2 培养基  35-36
    2.2.3 主要溶液和缓冲液  36-37
    2.2.4 试剂  37
    2.2.5 主要仪器和设备  37-38
  2.2 实验方法  38-42
    2.2.1 菌种的培养和保藏  38
    2.2.2 柔红霉素产生菌的发酵培养和产物分析  38-39
    2.2.3 链霉菌基因组DNA的提取  39
    2.2.4 Southern杂交  39-40
    2.2.5 PCR反应  40
    2.2.6 大肠杆菌感受态细胞制备  40-41
    2.2.7 大肠杆菌质粒转化(CaCl_2法)  41
    2.2.8 大肠杆菌质粒分离  41
    2.2.9 DNA片段的回收  41-42
    2.2.10 DNA序列的测定  42
  2.3 实验结果  42-51
    2.3.1 不同柔红霉素产生菌的平板培养和发酵产抗实验  42-44
    2.3.2 不同柔红霉素产生菌基因组DNA的提取  44-45
    2.3.3 不同来源的柔红霉素产生菌基因组DNA的Southern杂交分析  45-46
    2.3.4 PCR扩增doxA基因  46-48
    2.3.5 doxA基因的亚克隆和测序  48-51
    2.3.6 doxA基因的同源性分析  51
  2.4 讨论  51-52
  2.5 总结  52-54
3 链霉菌表达质粒的构建和doxA基因的表达  54-78
  3.1 实验材料  54-59
    3.1.1 菌种和质粒  54-56
    3.1.2 培养基  56
    3.1.3 主要溶液和缓冲液  56-58
    3.1.4 试剂  58
    3.1.5 主要仪器和设备  58-59
  3.2 实验方法  59-63
    3.2.1 链霉菌原生质体制备  59
    3.2.2 链霉菌质粒转化  59
    3.2.3 链霉菌质粒提取  59-60
    3.2.4 BamHI部分酶切实验条件的确定  60-61
    3.2.5 变铅青链霉菌的培养和菌丝体破碎  61
    3.2.6 SDS-PAGE蛋白电泳  61-63
  3.3 实验结果  63-74
    3.3.1 波赛链霉菌ATCC 29050来源的doxA基因表达质粒构建  63-65
    3.3.2 链霉菌表达载体质粒的构建  65
    3.3.3 天蓝淡红链霉菌SIPI 1482来源doxA基因表达质粒的构建  65-71
    3.3.4 PCR扩增表达质粒中的doxA基因  71
    3.3.5 波赛链霉菌ATCC 29050来源doxA基因在变铅青链霉菌中的表达  71-74
    3.3.6 天蓝淡红链霉菌SIPI 1482来源doxA基因在变铅青链霉菌中的表达  74
  3.4 讨论  74-76
  3.5 总结  76-78
4 doxA基因工程菌对柔红霉素的转化作用  78-95
  4.1 实验材料  79-80
    4.1.1 培养基  79
    4.1.2 主要仪器和设备  79-80
  4.2 实验方法  80-81
    4.2.1 工程菌的直接发酵培养  80
    4.2.2 工程菌对柔红霉素和阿霉素的转化  80
    4.2.3 工程菌培养上清液对柔红霉素的转化  80-81
    4.2.4 TLC分析方法  81
    4.2.5 HPLC分析方法  81
  4.3 实验结果  81-93
    4.3.1 工程菌的直接发酵代谢产物分析  81-82
    4.3.2 工程菌对柔红霉素的转化作用  82-85
    4.3.3 工程菌对阿霉素的转化作用  85-86
    4.3.4 工程菌培养上清液对柔红霉素的转化作用  86
    4.3.5 工程菌TK24(pYG57)转化柔红霉素条件的初步优化  86-93
  4.4 讨论  93-94
  4.5 总结  94-95
5 柔红霉素转化产物的分析  95-100
  5.1 实验材料  95-96
    5.1.1 柔红霉素转化抽提产物  95
    5.1.2 主要试剂和材料  95
    5.1.3 主要仪器和设备  95-96
  5.2 实验方法  96
    5.2.1 柔红霉素转化产物的分离纯化  96
    5.2.2 紫外可见吸收光谱分析  96
    5.2.3 柔红霉素转化产物的LS／MS分析条件  96
  5.3 实验结果  96-98
    5.3.1 转化产物的理化性质  96
    5.3.2 柔红霉素转化产物纯化后的紫外可见吸收光谱  96-97
    5.3.3 柔红霉素转化产物的LC／MS分析  97
    5.3.4 柔红霉素转化副产物的鉴定分析  97-98
  5.4 讨论  98
  5.5 总结  98-100
6 结论  100-101
参考文献  101-108
附录  108-117
致谢  117-118
综述报告和发表文章  118

柔红霉素C-14羟化酶基因的克隆、表达和应用研究

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