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马立克氏病病毒gB、gI、pp38基因的原核系统表达及其特异性单抗的研制和初步应用

作　者: 韩凌霞
导　师: 崔治中；秦爱建
学　校: 扬州大学
专　业: 禽病学
关键词: 马立克氏病病毒 gB基因 gI基因 pp38基因 间接免疫荧光抗体试验 酶联免疫吸附试验 斑点－酶联免疫吸附试验 免疫转印试验 单克隆抗体 火鸡疮疹病毒
分类号: S852.65
类　型: 博士论文
年　份: 2001年
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内容摘要


为了用免疫转印反应（Western-blot）作为指示系统来比较不同致病型马立克氏病病毒（MDV）主要蛋白质的“带型”（protein band pattern），本研究利用原核表达载体pGEX-6p-1质粒，构建了能分别表达gB、gI和pp38的重组载体质粒，以在大肠杆菌中表达的主要呈一级结构的重组gB、gI和pp38分别免疫小鼠，通过间接免疫荧光抗体试验（IFA），针对感染了MDV的鸡胚成纤维细胞（CEF）作为筛选用抗原，以期获得能在免疫转印反应中识别变性蛋白质中与一级结构相关的抗原表位的杂交瘤细胞。结果得到MDV的gB、gI和pp38的一组特异单克隆抗体。 用重组gB的N-片段GST融合蛋白免疫小鼠后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合反应，以能表达重组gB蛋白的细菌裂解物为检测抗原包被酶标板，筛选到6株ELISA阳性杂交瘤细胞，经亚克隆化获得了稳定分泌特异抗体的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞培养上清与GA株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）进行IFA反应，得到1株MDV特异性的单抗7C8。7C8单抗腹水与GA-CEF的IFA效价达1∶2000，免疫转印试验结果表明，7C8能对所有检测过的血清Ⅰ型MDV株感染CEF裂解液中清晰而稳定地识别出分子量大约为100kD、60kD、49kD的MDV囊膜糖蛋白B抗原。虽然国内外已有多株抗MDVgB单抗的报道，但这是第一株能在免疫转印反应中从Ⅰ型MDV感染细胞中稳定地检测出所有gB复合物的3条蛋白带的单克隆抗体。 用重组gI GST融合蛋白免疫后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，以648A感染的CEF为筛选抗原，通过IFA获得了9株gI特异性的杂交瘤细胞：分别命名为2H3、3H5、4B8、6E2、2E6、6F10、4H2、2H7、1B11。其中3株杂交瘤细胞2H3、6F10、2H7在单克隆化后腹腔注射BalB/C 小鼠，获得的腹水抗体稀释度在1∶100至1∶200之间均可与不同毒株MDV感染的CEF具有IFA反应性，与其裂解液在dot-ELISA中呈特异性显色，在免疫转印反应中，可从RB1B株、CVI988株感染 2 扬州大学博士论文CEF的裂解液中识别出大约32kD的＠蛋白带，这是国内外首次报道的MDVgl特异性的单克隆抗体。 用1型MDV疫苗株CVI988株来源的大肠杆菌表达的重组pp38免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，间接免疫荧光试验检测，筛选到8株抗pp38的单克隆抗体，分别命名为Zllll7、6GHS、gGA4、IGg、4ADZ、SGDS、gF10、6HCS。用其制备腹水单抗，在卜500稀释下可与所有1型MDV感染的CEF显示强IFA反应，其中gGA4、SGDS在兔疫转印反应中能从MDV感染CEF的裂解液识别出约35kD的特异性蛋白带。这些单克隆抗体填补了我国对pp38单抗的空白。特别引人注意的是，抗pp38单抗IGg、4ADZ、gGA4、SGDS不仅与所有测试过的1型MDV反应，还能与＊ 型HVT反应。这一结果表明，Ill型HVT与互型MDV间存在能被单抗识别的共同的抗原表位。这一结果进一步直接证实了我们过去用在昆虫细胞中表达的重组pp38做交叉免疫反应所作出的“在＊和＊型MDV中存在着与I型MDVpp38有一定同源性的蛋白多肽”的推论，并进而可进一步识别出这一个（或几个）共同表位的在pp38及其类似物上的位置及氨基酸序列。这是国际上第一组能显示1型和Ill型MDVpp38共同表位的单克隆抗体。 本研究研制的针对 gB、gi和 pp38的多株单克隆抗体的组合，有可能进一步用于探索不同致病型MDV在细胞中表达的不同蛋白质“带型”的研究，即比较不同毒株在细胞和组织中相关蛋白质表达量的比例关系上的差异，及不同蛋白质由于表达后再加工程度不同而造成的电泳迁移率的差异。针对gB上与变性蛋白一级结构相关抗原表位的单克隆抗体7C8亦可用于表达gB的基因工程疫苗病毒的表达特性的研究，对掣的单抗也可用作筛选重组9－禽痘病毒的重要试剂。

全文目录


一． 中文摘要  3-5
二． 英文摘要  5-7
三． 文献综述  7-45
  （一） 鉴别MDV毒力变异的意义及进展  7-14
  （二） MDV毒力变异及防制的发展状况  14-27
  （三） MDV分子病理学研究进展  27-37
  （四） 疱疹病毒糖蛋白gI在病毒感染细胞中的作用  37-45
四． 研究内容  45-96
  （一） MDV gB基因N-端片段在大肠杆菌中的表达  45-64
  （二） MDV gB基因原核表达产物单克隆抗体的制备  64-79
  （三） MDV gI原核表达产物单克隆抗体的制备及其抗原性分析  79-87
  （四） CVI988 pp38基因大肠杆菌表达产物的单克隆抗体制备  87-96
五． 致 谢  96-97

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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