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猪细胞巨化病毒四川株gB基因的克隆、原核表达及抗原性分析

作　者: 史小红
导　师: 徐志文；郭万柱
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪细胞巨化病毒 gB基因 序列分析 克隆表达 抗原性分析
分类号: S852.659.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


猪细胞巨化病毒(PCMV)是第二个被发现的猪疱疹病毒,属于β疱疹病毒亚科,可引起猪包涵体鼻炎病。该病自从于1995年首次在英国发现以来,在猪群中分布相当广泛,日本及欧美的血清抗体阳性率都在90%以上。囊膜蛋白gB做为一种必须蛋白,在所有疱疹病毒感染寄主细胞的粘附,穿入,产生细胞融合及扩散的过程中发挥着不可替代的作用,该蛋白同时具有具有良好的免疫保护性及免疫原性。本实验对PCMV gB基因进行了以下研究：1.猪细胞巨化病毒gB的全克隆及pET30-gB重组表达质粒的构建(1)设计引物、PCR扩增出PCMV gB基因目的片段及原核表达基因片段。(2)利用生物信息学软件对PCMV gB基因进行分析及推导蛋白的功能进行预测,表明PCMV gB基因大小为2580bp,编码860aa,与人疱疹病毒6型或7型的MCP基因亲缘关系较近,肽链N-端的1-23氨基酸为信号肽,并在729-751aa间含有跨膜区,蛋白分子整体亲水性较好,抗原位点分布于gB多肽链的整个序列中。(3) EcoRⅠ和SalⅠ限制内切酶双酶切目的片段和质粒pET30(+),将gB基因目的片段连接pET30(+)上,构建融合表达重组质粒pET30-gB。2.重组质粒pET30-gB在大肠杆菌中的表达及表达产物的分离纯化利用IPTG对重组质粒进行诱导表达时发现,重组质粒在37℃、IPTG浓度为0.6mmol/L下诱导4h后可高效的表达出分子量约为80KD的目的蛋白,此外,本实验采用His柱亲和层析对重组蛋白进行分离纯化。3.PCMV gB重组蛋白的抗原性分析将纯化后的蛋白免疫家兔获得多克隆抗体后,进行琼脂糖扩散实验的最高的阳性稀释滴度为1：16,表明PCMV gB重组蛋白具有良好的免疫原性。用Western-Blot说明重组PCMV gB蛋白具有较好的反应原性。本研究完成了对PCMV gB的基因的全克隆,并对该序列及其推导的蛋白进行了较全面生物信息学分析,实现了PCMV gB基因的融合表达,并制备了该重组蛋白的多克隆抗体,对该重组蛋白的抗原性进行了分析,为进一步制备高特异性和高敏感性的PCMV基因工程抗原试剂盒奠定了基础,也为研究猪细胞巨化病毒亚单位疫苗奠定了基础。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-19
  1. 猪细胞巨化病毒的研究进展  9-15
    1.1 病原学  9-11
    1.2 流行病学  11
    1.3. 猪巨细胞病毒蛋白及其功能  11-12
    1.4 临床症状  12-13
    1.5 病理变化  13
    1.6 诊断  13-14
    1.7 防治  14-15
  2 疱疹病毒GB基因及其编码蛋白的研究进展  15-18
    2.1 疱疹病毒gB基因基因的研究进展  15
    2.2 gB基因的作用  15-16
    2.3 gB基因编码产物糖蛋白B的结构特点  16
    2.4 gB蛋白的作用机理  16-17
    2.5 gB蛋白在免疫学上的研究  17-18
  3 展望  18
  4 选题目的和意义  18-19
实验部分  19-64
  1. 材料  19-23
    1.1 实验材料  19
    1.2 主要仪器  19-20
    1.3 主要溶液及配制  20-23
  2. 实验方法  23-39
    2.1 PCMV gB基因的克隆及生物信息学分析  23-27
    2.2 扩增PCMV gB原核表达基因序列  27-28
    2.3 基因的T克隆与鉴定  28-30
    2.4 PCMV gB基因重组表达菌的构建  30-31
    2.5 重组表达菌株的诱导表达及表达条件的优化  31-34
    2.6 重组蛋白的纯化  34-35
    2.7 多克隆抗体制备  35-36
    2.8 PCMV gB蛋白原核表达产物的抗原性分析  36-39
  3. 结果与分析  39-55
    3.1 PCMV gB基因的克隆及生物信息学分析  39-47
    3.2 扩增PCMV gB蛋白原核表达基因序列  47-48
    3.3 基因的T克隆与鉴定  48
    3.4 重组表达菌株的构建  48-49
    3.5 重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化  49-52
    3.6 重组蛋白的纯化  52-53
    3.7 PCMV gB蛋白原核表达产物的抗原性分析  53-55
  4 讨论  55-63
    4.1 PCMV gB基因的克隆  55
    4.2 PCMV gB基因核苷酸序列的分析  55-56
    4.3 PCMV gB基因编码蛋白序列的生物信息学分析  56-59
    4.4 表达系统的选择  59-60
    4.5 表达条件的优化  60-61
    4.6 包涵体的形成和表达蛋白的分离  61
    4.7 多克隆抗体的制备  61-62
    4.8 PCMV gB蛋白原核表达产物的抗原性分析  62-63
  5. 结论  63-64
参考文献  64-68
致谢  68

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学 > 单股DNA病毒
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