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人血管内皮生长因子及其受体Flt-1功能域在巴氏毕赤酵母中的表达和生物学活性的研究

作　者: 马骊
导　师: 王小宁；郭亚军；张智清
学　校: 第一军医大学
专　业: 分子免疫学
关键词: 血管内皮生长因子受体酵母双杂交巴氏毕赤酵母基因表达
分类号: R392.11
类　型: 博士论文
年　份: 2000年
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内容摘要

血管内皮生长因子（vascular endothelium growth factor，VEGF）是血管内皮细胞的特异丝裂原，具有促进血管内皮细胞增殖，加速新血管形成的作用。VEGF是通过与血管内皮细胞表面的特异性受体结合而发挥其生物学效应的，在胚胎发育和心血管、肿瘤等疾病的发病和防治中具有重要作用。本文着重从以下三个方面对VEGF及其受体Flt-1进行了研究。一、人血管内皮生长因子VEGF₁₆₅在Pichia.pastoris中的表达、纯化及其生物学活性检测利用PCR技术，从phVEGF₁₆₅·SR真核表达质粒扩增出hVEGF₁₆₅ cDNA，构建酵母分泌型表达质粒pPIC9K/hVEGF₁₆₅，分别用单交换和双交换的方法将目的基因整合到两种宿主菌GS115和KM71的染色体上。鉴定转化子表型（His⁺Mut^s和His⁺Mut⁺），G418加压筛选多拷贝整合菌株，经甲醇诱导在Pichia.pastoris酵母中实现了hVEGF₁₆₅的高效分泌性表达，SDS-PAGE显示其表达量占上清中蛋白总量的60％左右，蛋白质定量分析示其产量约为0.3g/L。ELISA和Western blot表明，表达产物具有hVEGF₁₆₅抗原性。表达产物经Hepsrin-sepharose CL6B亲和层析纯化后，纯度可达90％以上。分别采用HUVEC细胞株MTT比色法及³H-TdR掺入法对重组hvEGF₁₆₅的生物学活性进行了测定，两种方法结果完全一致，证实表达产物能特异性刺激HUVEC的增殖，具有天然VEGF的生物学活性。二、利用酵母双杂交系统研究人血管内皮生长因子受体Flt-1的配体结合域利用RT-PCR技术，从HUVEC中扩增出四个截短的Flt-1 cDNA，分别含胞外第2，1-2，2-3和1-3个loop。构建融合表达质粒pGBT9/hVEGF₁₆₅和pGAD424/Flt-1（2）、pGAD424/Flt-1（1-2）、pGAD424/Flt-1（2-3）、pGAD424/Flt-1（1-3），并将pGBT9/类质粒与pGAD424/类质粒两两配对转化酵母菌SFY526，采用滤纸法和液体培养法对阳性克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析，结果显示，Flt-1（1-3）/hVEGF₁₆₅转化子2h显蓝色，平均活性为65.2IU；Flt-1（2-3）/hVEGF₁₆₅转化子4h显色，平均活性为50.8IU；Flt-1（1-2）/hVEGF₁₆₅转化子10h显色，平均活性为17.5IU；而Flt-1（2）/hVEGF₁₆₅转0 第一军医大学九七届博士学位论文（国家“‘863”计划资助课题）化子即使 30h以上也没有颜色反应。说明不仅 13lOOp能与 VEGF结合，比其更小的］片段2－3100p也具有与其配体结合的能力，且结合能力与 1－310Op斥较接近，1－21。＊】的结合力较弱，单独第2个1刚叩无配体结合能力。I 三、FIt－1胞外1－3和2－3looP在PJCbi。P。storjs中的表达、纯化及其生物学活0 性检测0 构建酵母分泌型表达质粒 PPICgK／Fit＊（13）和 PPICgK／Fit一1（2一3），利用OPIChia．pasto厂is 酵母表达系统实现TFlt 一1（1一3）和Fit 一1（2一3）的高效分泌性表l 达，SDS－PAGE显示其表达量占上清中总蛋白的60％以上，产量约为0．35g／L，ELIS＾及Western blot表明，表达产物具有良好的抗原性和特异性。两种表达产物经 CM一sepharose fast fbwF 离子又换层析和 Sephacryl一100凝D 胶过滤层析纯化后，纯度可这90％以上。］固相结合实验、固相竟争性结合实验、细胞竞争性结合实验、HUVEC细胞株 MTT］t匕色法及屯呵dR掺入法等检测方法证实重组 Fit叶（1刁）和 Fit叶Q刁)都具有结合IhVEGF；。。的能力和抑制 hVEGF；。。对 HUVEC 勺促增殖功能，其中前者的作用更为明显，I 但二者相差不大。本文成功地利用PIChja．pssto汀s酵母表达系统，高效表达了hVEGF；。。，并证实J 其具有天然 VEGF的生物学活性，这对于开发其在缺血性。。脏病及肢体继发性动脉闭J 塞等疾病的防治开辟了广阔的前景。首次成功地利用酵母双杂交系统，高效筛选出－ Fit－1胞卜最J、g己体结合域一2－3looP，并在Pj奶ia．P。sic。is酵母表达系统中买现了其高效分泌性表达，体外生物学活性实验证实其具有与VEGF结合的能力和抑制D VEGF对HUVEC的促增殖功能，这为进一步研究其在动物水平阻断VEGF的病理作用打下了良好基础，为临床预防和治疗肿瘤、糖尿病性视网膜病变等血管生成相关疾病D 提供了新的手段。

全文目录

缩略词表  3-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-15
第一部分人血管内皮生长因子VEGF_（165）在Pichia．pastoris中的表达、纯化及其生物学活性检测  15-39
  材料方法  15-27
  结果  27-35
  讨论  35-38
  小结  38-39
第二部分利用酵母双杂交系统研究人血管内应生长因子受体Flt-1的配体结合域  39-61
  材料方法  39-45
  结果  45-56
  讨论  56-60
  小结  60-61
第三部分人血管内皮生长因子受体Flt-1胞外1-3，2-3loop在Pichia．pastoris中的表达、纯化及其生物学活性检测  61-78
  材料方法  61-63
  结果  63-74
  讨论  74-77
  小结  77-78
综述之一甲基营养型酵母—Pichia．pastoris基因表达系统  78-87
综述之二血管内皮生长因子及其受体的结构和功能  87-93
参考文献  93-101
发表文章  101-103
致谢  103

人血管内皮生长因子及其受体Flt-1功能域在巴氏毕赤酵母中的表达和生物学活性的研究

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