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大豆结瘤中miRNA的筛选及功能研究

作　者: 李卉
导　师: 武天龙
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 新发现的microRNA 大豆 结瘤 Northern杂交 生物信息学 过量表达
分类号: S565.1
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


大豆是世界上具有重要经济价值的农作物,大豆和微生物的互作诱导共生器官根瘤的产生,根瘤是固氮作用发生的组织,对大豆的生长发育提供重要的营养元素。大豆根瘤形成的研究已经进入了分子生物学领域,越来越多的miRNA在豆科植物中被发现,它们对豆类植物的生长发育均起着重要作用。在大豆中与根瘤相关的microRNA仅有极少数报道,研究新发现的miRNA在结瘤过程中的作用,明确这些miRNA的功能就显得尤为重要。本研究从本实验室前人工作中已经整合得到的35个新发现的microRNA中,分析和选择在数据库中至少有10个重复的microRNA,得到17个microRNA被随后用于本研究。本试验用根瘤菌USDA110侵染栽培品种Williams82后于不同时间点,通过Northern杂交的方法,对17个新发现的microRNA进行检测,获得6个有表型的microRNA,这6个microRNA分别是miR482、miR1507、miR1511、miR1512、miR1515和miR1521,发现它们在不同时间点表型各不相同,说明不同的新发现的miRNA在根瘤发育的不同阶段具有不同的表达量,启示这些新发现的miRNA在根瘤发育中不同时间或许起着不同的调控作用。随后用生物信息学方法在基因组数据库中对它们进行基因组定位,发现它们分布在1号、2号、10号、11号、17号和18号染色体上,表明它们在大豆不同组织中或许起着不同的调控作用。经过Northern杂交检测这6个miRNA在Williams 82的根、茎、叶、花、嫩荚、R5和R6的种子共7个组织中的表型,发现miR1512仅在根中表达,而其它5个miRNA在不同组织中均有表达,但是表达量和表达趋势各不相同。进一步用生物信息学软件筛选出这6个miRNA的10个候选miRNA前体,再用RNA mFold对这些前体的二级结构进行了预测,发现大豆中由根瘤菌诱导的miRNA前体在结构和长度上则存在多样性,它们介于95~145个碱基之间,表明这些miRNA在基因表达的调控中起到的作用也不尽相同;miRNA成熟序列在前体中位置上也具有多样性,有3个miRNA定位在它们前体的3′端,有2个miRNA定位在它们前体的5′端,10个前体的最小折叠自由能介于-36.6~ -63.8,具有较低的自由能,表明了这些前体预测的正确性。对上述6个经W82筛选出来的新发现的miRNA在品种Bragg中的不同时间点即0h,6h,12h,2d,6d进行检测,发现6个miRNA在不同时间点的表型和其在W82中相似。随后用Bragg的2个大豆突变体检测这些miRNA的表型,发现它们在不同突变体中的表型不同,根瘤菌B. japonicum诱导,miR482和miR1521或许并不受结瘤因子受体基因NFR1和大豆根瘤自动调控接受酶GmNARK1信号调控,但miR1511和miR1512受到调控;miR1515仅受GmNARK1调控,而不受NFR1调控。为了进一步研究上述6个miRNA的功能,我们对其靶基因进行了预测。通过生物信息学及在线大豆基因数据库,从1505条序列中筛选出来19条序列作为候选靶基因。通过Reverse Transcript -PCR的方法,对预测到的靶基因在W82不同组织、不同时间点进行检测,将得到的至少在根中表达的8个靶基因用根瘤菌侵染突变体后不同时间点的根进行定量分析,结果发现miR1521和其靶基因Gm0022x00379的表型十分匹配。并通过5’-RACE的方法对miR482,miR1512和miR1515在靶基因上的结合位点进行验证,最后miR482和miR1515在预测结合位点处同靶基因结合,但miR1512并未在预期的结合位点与靶基因结合,这可能是由于有其它机制的调控作用。在筛选出来的6个miRNA中,有4个miRNA的靶基因具有良好的表型,即miR482、miR1507、miR1512和miR1515,它们被用于研究在根瘤发育过程中的作用。构建了两套gateway过量表达载体,分别由组成型启动子CsVMV和对仅根瘤菌应答的大豆ENOD40启动子启动。通过毛状根系统生成的转基因根,用Northern杂交确证miRNA被过量表达。借助毛状根系统,设计三次根瘤统计重复实验,发现CsVMV载体系统中,miR482的根瘤数目显著增多,约是对照的2倍;miR1515的根瘤数目约是对照的1.5倍,差异显著(P<0.05),这些结果表明miR482和miR1515在大豆根中对根瘤形成过程起到一定调控作用。而过量表达的miR1507和miR1512并未引起根瘤数目的显著变化。ENOD40载体系统中,miR482的根瘤数目显著增多,约是对照的2倍;miR1512的根瘤数目亦显著增多。miR1515和miR1507并没有显著地引起根瘤数目的变化,结果表明miR482、miR1512,miR1515或许在大豆结瘤过程中起了重要的作用。

全文目录


摘要  3-7
ABSTRACT  7-19
第一章 文献综述  19-53
  1 microRNA 的发现及生物合成机制  19-25
    1.1 microRNA 的发现  19-20
    1.2 microRNA 的生物合成机制  20-23
    1.3 microRNA 调节靶基因的机制  23
    1.4 microRNA 与siRNA 的联系与区别  23-24
    1.5 植物microRNA 的特点  24-25
  2 鉴定植物microRNA 的方法  25-29
    2.1 组织特异性克隆  26
    2.2 基于生物信息学克隆  26-28
    2.4 正反向遗传克隆  28-29
  3 microRNA 数据库  29-30
  4 microRNA 的功能  30-34
    4.1 植物miRNA 对植物生长发育的影响  30-32
    4.2 植物miRNA 对植物抗胁迫的影响  32-34
  5 microRNA 在豆科植物中的研究  34-41
    5.1 豆科植物与微生物的共生  34-35
    5.2 豆科植物与根瘤菌共生固氮各阶段的信息传递和基因表达  35-37
    5.3 豆科植物中的microRNA  37-38
    5.4 与结瘤相关的microRNA  38-41
  6 Gateway 技术的原理及应用  41-44
  参考文献  44-53
第二章 本研究的意义和内容  53-59
  1 本研究的意义  53-54
  2 本研究的基础  54-55
  3 本研究的内容  55-56
  参考文献  56-59
第三章 microRNA 的初步筛选  59-84
  1 材料  60-62
    1.1 植物材料  60
    1.2 菌株  60
    1.3 试剂与配方  60-62
    1.4 实验设备  62
    1.5 Northern 杂交探针  62
  2 实验方法  62-65
    2.1 大豆的种植  62-63
    2.2 大豆根瘤菌的培养  63
    2.3 大豆取材  63
    2.4 microRNAs 的制备  63-64
    2.5 Northern 杂交  64-65
  3 实验结果与分析  65-80
    3.1 microRNAs 在大豆被诱导的根部中表达  65-67
    3.2 microRNAs 在大豆基因组中的定位  67-69
    3.3 miRNAs 在大豆组织中的特异表达  69-70
    3.4 microRNAs 前体的预测  70-80
  4 讨论  80-82
    4.1 miRNA StarFire 系统能够有效提高Northern 杂交的灵敏度  80-81
    4.2 microRNA 的前体预测  81-82
  参考文献  82-84
第四章 microRNAs 在突变体中的表达  84-93
  1 材料  85
    1.1 植物材料  85
    1.2 菌株  85
    1.3 试剂与配方  85
    1.4 实验设备  85
  2 实验方法  85-86
    2.1 大豆突变系的种植  85
    2.2 大豆根瘤菌的培养  85
    2.3 大豆突变系的取材  85
    2.4 microRNA 的制备  85
    2.5 Northern 杂交  85-86
  3 实验结果与分析  86-89
    3.1 microRNA 在对照Bragg 中的表型和在W82 中相同  86-87
    3.2 microRNA 在突变系中的表型  87-89
  4 讨论  89-91
  参考文献  91-93
第五章 microRNAs 靶基因的预测及验证  93-116
  1 材料  94-95
    1.1 植物材料  94
    1.2 质粒与菌株  94
    1.3 试剂与配方  94
    1.4 实验设备  94
    1.5 RT-PCR，qRT-PCR 引物  94-95
    1.6 5'-RACE 引物  95
  2 实验方法  95-104
    2.1 microRNA 的提取  95
    2.2 RNA 反转录合成cDNA  95-96
    2.3 靶基因的RT-PCR 筛选  96
    2.4 靶基因的定量RT-PCR  96-97
    2.5 用于靶基因5'-RACE 鉴定的m RNA 制备  97-98
    2.6 靶基因的5'-RACE  98-100
    2.7 胶回收  100-101
    2.8 pGEM-T Easy 载体连接反应产物  101
    2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备  101-103
    2.10 pGEM-T Easy 载体连接反应产物的转化（蓝白斑筛选）  103
    2.11 质粒DNA 的少量制备  103-104
  3 实验结果与分析  104-112
    3.1 靶基因的生物信息学预测  104-107
    3.2 靶基因的RT-PCR 表型  107-108
    3.3 靶基因的qRT-PCR 分析  108-112
    3.4 靶基因的5'-RACE 验证  112
  4 讨论  112-114
  参考文献  114-116
第六章 microRNAs 在根瘤发育的作用  116-136
  1 材料  117
    1.1 植物材料  117
    1.2 菌株  117
    1.3 质粒载体  117
    1.4 试剂与配方  117
    1.5 实验设备  117
  2 实验方法  117-123
    2.1 大豆的种植  117
    2.2 发根农杆菌的共转化  117-118
    2.3 大豆的毛状根转化  118
    2.4 基因组DNA 的小量提取  118-119
    2.5 PCR 扩增miRNA 的前体基因  119-120
    2.6 酶切反应  120
    2.7 miRNA 的前体与入门载体的连接  120
    2.8 大肠杆菌的转化  120-121
    2.9 转化产物的鉴定  121
    2.10 过量表达目的载体的构建  121-122
    2.11 目的载体的鉴定  122
    2.12 发根农杆菌K599 感受态细胞的制备  122-123
    2.13 发根农杆菌K599 的转化  123
  3 实验结果与分析  123-133
    3.1 Gateway 过量表达目的载体的构建  123-127
    3.2 重组质粒中miRNAs 过量表达  127-128
    3.3 组成型表达的miRNA 能够引起结瘤数目的变化  128-130
    3.4 结瘤诱导的miRNA 能够引起结瘤数目的变化  130-133
  4 讨论  133-134
  参考文献  134-136
第七章 研究结论与展望  136-139
  1 研究主要结论  136-137
  2 创新之处  137
  3 研究中存在的问题  137-138
  4 今后工作展望  138-139
附录 缩写词表  139-141
攻读博士期间发表、拟发表的论文和专利  141

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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