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小鹅瘟强毒在人工感染雏鹅体内侵染规律及对消化道菌群结构影响的分子解析

作　者: 杨金龙
导　师: 程安春；汪铭书
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 小鹅瘟病毒 雏鹅 动态分布 实时荧光定量 PCR 变性梯度凝胶电泳 ERIC-PCR 16S-rDNA
分类号: S858.33
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 172次
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内容摘要


鹅细小病毒,又称小鹅瘟病毒(Goose Parvovirus,GPV),与人细小病毒HPV、牛细小病毒BPV、犬细小病毒CPV以及猪细小病毒PPV等同属于具有单股线状DNA的细小病毒属病毒的成员。目前世界许多饲养鹅及番鸭地区都有本病的发生,特别是在我国的一些省(市、自治区)的流行、传播速度快,发病率和死亡率较高,给养鹅业造成严重危害,带来重大的经济损失,是目前危害养鹅业的主要传染病之一。虽然已建立了针对GPV特异、敏感的PCR诊断方法,但传统PCR无法对病毒核酸进行准确的定量分析,而对病毒基因组的定量研究在病毒学中有着非常重要的意义,是研究病毒的组织细胞嗜性、致病机理及筛选有效抗病毒药物的有力工具。肠道菌群结构的变化对鹅细小病毒病的发生、发展和转归的影响是一个不容忽视的问题。本文采用不同的研究方法、从不同的角度对健康及感染小鹅瘟病毒雏鹅的消化道菌群结构进行分子解析,获得如下结果:1.本试验以小鹅瘟病毒CH_V强毒株为致病原、以7日龄雏鹅为实验动物,建立细小病毒病动物模型,在国内外首次采用TagMan MGB探针实时荧光定量PCR技术(FQ-PCR)扩增GPV强毒CH_V株的VP3基因,对不同感染途径病毒在体内的分布规律进行实时定量检测,了解其在鹅体内分布规律与鹅临床表现及病程发展的关系,为临床防治提供理论依据。结果表明:(1)优化的FQ-PCR方法可在2 h内实现对GPV的快速定量检测,最低检测限为28 copies/μL,是普通PCR灵敏度的1000倍。(2)口服4 h后雏鹅的食道既可检出GPV DNA,滴鼻感染4 h后雏鹅的气管可检出GPV DNA;注射感染4 h后除雏鹅的肠道、食管、气管、脑、肺外,其它组织均可检测出GPV DNA;12 h后各组织器官中都能检测到GPV DNA,2-9天逐渐达到高峰,之后逐渐减少;GPV DNA含量最多的是肝脏、脾、脑、哈德氏腺等器官。2.采用DGGE技术,对不同途径感染GPV的小鹅肠道菌群结构进行动态的分析,以期揭示肠道菌群结构在感染肠道病毒后的总体变化规律。结果表明:临床健康对照鹅肠道菌群结构相对稳定,PCR-DGGE条带数量以盲肠最多(13条),其次是直肠(12条)、空肠(11条)和回肠(11条),十二指肠最少(8条)。皮下感染鹅各肠段随着感染时间的延长,其PCR-DGGE条带数呈逐渐减少再慢慢恢复正常的趋势;口服感染鹅各肠段PCR-DGGE扩增条带数随着感染时间的延长,呈现先逐渐减少,再慢慢恢复正常的趋势:滴鼻感染鹅各肠道中菌群结构变化与其它两种感染途径引起的变化相似,只是时间延后;死亡鹅各肠段中PCR-DGGE条带数最少。表明鹅细小病毒感染鹅的途径与其致病力密切相关、与感染鹅肠道菌群结构我破坏程度密切相关。3.建立了鹅粪细菌的16S rDNA文库,从鹅粪的16S rDNA文库中获得了5个优势条带进行测序分析。BLAST分析结果显示,在鹅粪的5个优势菌群中,其中4种菌分别与大肠杆菌属、芽孢杆菌、乳酸杆菌、肠球菌成员有96%以上的同源性,而感染GPV后肠道优势菌群则增加了沙门氏杆菌,说明感染GPV后鹅肠道菌群发生了根本性的改变。4.ERIC-PCR是近年研究肠道菌群结构及种群变化的最新分子生物学技术之一,该方法直接根据样品ERIC条带的分布、数量和亮度等信息,分析肠道样品菌群的结构和种群的变化,具有快速、简洁,不依赖纯培养的特点。与其他方法相比,其灵敏度、可重复性和可靠性更好,且省时省力,我们采用ERIC-PCR技术,对不同途径感染GPV的小鹅肠道菌群结构进行动态的分析,以期揭示肠道菌群结构在感染肠道病毒后的总体变化规律。与DGGE检测结果相似:临床健康对照鹅肠道菌群结构相对稳定,ERIC-PCR条带数量以盲肠最多,其次是直肠、空肠和回肠,十二指肠最少。皮下感染鹅各肠段随着感染时间的延长,其ERIC-PCR条带数呈逐渐减少的趋势;口服感染鹅各肠段ERIC-PCR扩增条带数随着感染时间的延长,呈现先逐渐减少,再慢慢恢复正常的趋势;滴鼻感染鹅各肠道中菌群结构变化与口服组相似,只是时间延后;死亡鹅各肠段中ERIC-PCR条带数最少。表明鹅细小病毒感染鹅的途径与其致病力密切相关、与感染鹅肠道菌群的失调程度密切相关。5.关于鹅消化道正常菌群的动态分布、变化及鹅感染小鹅瘟病毒后其体内的正常菌群的动力学变化目前尚无系统性的研究资料,而且建立快速、准确、能够定量检测机体内一些正常菌群的检测方法对于辅助治疗小鹅瘟也是非常必要的。虽然ERIC-PCR、DGGE-PCR等指纹图谱技术能很好地分析消化道的菌群结构,但却不能将细菌的数量进行精确的测定。鉴于此,我们采用Taqman-MGB探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测技术,建立大肠杆菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属和乳酸杆菌属的实时荧光定量PCR检测方法,对经感染小鹅瘟病毒鹅的消化道内正常菌群大肠杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌属及乳酸杆菌等鹅体内常见的特定菌群的数量变化规律进行研究,系统地分析鹅消化道这四种菌群的动态分布、变化,为正常菌群与机体的关系及对小鹅瘟发病机制的影响提供实验依据。结果表明:与正常对照鹅相比,不同途径感染鹅细小病毒CH_V强毒株鹅消化道内检测的四种细菌的基因组拷贝数均不同程度的发生了变化。其中大肠杆菌属细菌数量出现峰值的时间顺序为皮下组＞口服组＞滴鼻组;乳酸杆菌细菌整体含量高低顺序为滴鼻组＞口服组＞皮下组;其他二种细菌三个攻毒途径的变化趋势相近,但波动大小顺序为皮下组＞口服组＞滴鼻组。表明细菌失调程度与鹅细小病毒感染途径密切相关。

全文目录


中文摘要  10-13
Abstract  13-17
Abbreviatioms  17-18
第一部分 文献综述  18-60
  第一章 小鹅瘟(GP)研究进展  18-32
    1 GP概述  18-27
      1.1 鹅细小病毒(GPV)的病原学特性  18-22
        1.1.1 GPV的分类地位  18-20
        1.1.2 GPV的理化特性  20
        1.1.3 GPV的血凝特性  20-21
        1.1.4 GPV的血清类型  21
        1.1.5 GPV的分离培养  21-22
      1.2 GP流行病学、临床及病理学特性  22-25
        1.2.1 GP流行病学特性  22
        1.2.2 GP的临床学特征  22-23
        1.2.3 GP的病理学特征  23-25
      1.3 GP的诊断  25-26
        1.3.1 病毒分离  25
        1.3.2 血清学诊断方法  25-26
        1.3.3 分子生物学诊断  26
      1.4 GP的防治  26-27
        1.4.1 预防  26-27
        1.4.2 治疗  27
    2 GPV的分子生物学研究进展  27-32
      2.1 GPV毒粒结构  27
      2.2 GPV基因组结构  27-28
      2.3 GPV的转录与复制  28-30
      2.4 GPV结构蛋白  30-31
      2.5 GPV非结构蛋白  31-32
  第二章 消化道菌群结构解析方法的研究进展  32-60
    1 消化道菌群结构传统的解析方法  32-38
      1.1 分离技术  32-34
        1.1.1 非选择性方法  32-33
        1.1.2 选择性方法  33-34
      1.2 鉴定方法  34-38
        1.2.1 培养后的理化鉴定方法  34-35
        1.2.2 直接理化鉴定方法  35-38
    2 消化道菌群结构的现代分子解析方法  38-60
      2.1 基因序列分析技术  40-44
        2.1.1 16SrRNA基因序列分析  40-42
        2.1.2 ITS序列分析  42-43
        2.1.3 recA基因序列分析  43-44
      2.2 表型指纹图谱分析  44
      2.3 基因型指纹图谱分析  44-48
        2.3.1 菌落核酸杂交  45-46
        2.3.2 脉冲场凝胶电泳  46-47
        2.3.3 核型分析  47
        2.3.4 16S rDNA基因的限制性片段长度多态性  47-48
      2.4 依赖于PCR的基因指纹图谱技术  48-60
        2.4.1 单链构象多态性技术  48-49
        2.4.2 16SrDNA的随机扩增多态性指纹图谱  49-50
        2.4.3 ERIC-PCR技术  50
        2.4.4 温度梯度凝胶电泳和变性梯度凝胶电泳技术  50-60
第二部分 实验研充  60-144
  第三章 FQ-PCR检测鹅细小病毒在不同感染途径雏鹅体内侵染规律的研究  60-78
    1 试验材料  61-63
      1.1 质粒与菌(毒)株  61-62
      1.2 试验动物  62
      1.3 试剂  62
      1.4 仪器及耗材  62-63
      1.5 主要试剂的配制  63
    2 试验方法  63-67
      2.1 FQ-PCR检测GPV DNA方法的建立  63-65
        2.1.1 引物设计与合成  63-64
        2.1.2 标准品的制备与鉴定  64
        2.1.3 FQ-PCR检测GPV DNA反应条件的优化  64
        2.1.4 FQ-PCR检测GPV DNA方法的灵敏性分析  64-65
        2.1.5 FQ-PCR检测GPV DNA特异性的确定  65
        2.1.6 FQ-PCR检测GPV DNA方法的重复性分析  65
        2.1.7 FQ-PCR检测GPV DNA标准曲线的建立  65
      2.2 试验动物分组和处理  65
      2.3 样品采集部位和处理方法  65-66
      2.4 模板DNA的抽提  66-67
        2.4.1 组织中GPVDNA的抽提  66
        2.4.2 血液中GPVDNA的抽提  66-67
      2.5 样品的检测分析  67
    3 试验结果  67-74
      3.1 标准阳性模板质粒DNA浓度的测定  67
      3.2 FQ-PCR检测GPV DNA的反应条件  67-69
      3.3 FQ-PCR检测GPV DNA方法的灵敏性  69-70
      3.4 FQ-PCR检测GPV DNA方法的特异性  70-71
      3.5 FQ-PCR检测GPV DNA方法的重复性  71
      3.6 FQ-PCR检测GPV DNA的标准曲线  71-72
      3.7 小鹅瘟强毒株在雏鹅体内分布规律的检测结果  72-74
    4 讨论  74-76
    5 小结  76-78
  第四章 鹅消化道菌群分析技术PCR-DGGE方法的建立  78-97
    1 试验材料  79-81
      1.1 试验动物和样品采集及处理方法  79
      1.2 主要试剂  79
      1.3 主要仪器  79-80
      1.4 溶液配制  80-81
    2 试验方法  81-84
      2.1 肠道细菌总DNA的提取  81-82
      2.2 肠道细菌总DNA的纯度测定  82
      2.3 肠道细菌总DNA的质量测定  82
      2.4 PCR扩增细菌16SrRNA变异区  82-83
      2.5 DGGE分析  83-84
        2.5.1 制备变性梯度胶  83-84
        2.5.2 电泳  84
        2.5.3 染色  84
        2.5.4 成像与分析  84
    3 试验结果  84-93
      3.1 GPV感染鹅临床观察  84-85
      3.2 样品微生物总DNA的提取  85-86
      3.3 样品DNA溶液在不同波长下的吸光值  86-87
      3.4 细菌基因组总DNA 16S rDNA V3区扩增  87
      3.5 细菌基因组16S rDNA V3区扩增DNA片段DGGE分析  87-93
        3.5.1 正常对照组细菌群落变化  87-88
        3.5.2 小鹅瘟病毒注射感染组雏鹅各肠段细菌群落的变化  88-90
        3.5.3 口服小鹅瘟病毒组雏鹅各肠段的细菌群落变化  90-91
        3.5.4 小鹅瘟病毒滴鼻感染组雏鹅各肠段的细菌群落变化  91-93
    4 讨论  93-95
      4.1 在DGGE分析中,PCR反应的优化  93-94
      4.2 小鹅瘟病毒对肠道微生物群落变化的影响  94-95
    5 小结  95-97
  第五章 16S RRNA基因序列技术分析不同途径感染GPV后鹅消化道菌群结构变化  97-109
    1 试验材料  97-99
      1.1 试验样品  97-98
      1.2 主要仪器  98
      1.3 主要试剂  98-99
    2 试验方法  99-102
      2.1 核酸提取  99
      2.2 PCR反应及产物的纯化  99-100
      2.3 16S rDNA克隆及插入子的检测  100-102
        2.3.1 PCR产物与pMD 18-T载体的连接  100
        2.3.2 感受态细胞的制备  100-101
        2.3.3 快速质粒转化方法  101
        2.3.4 质粒DNA的提取  101-102
        2.3.5 插入子的检测  102
      2.4 PCR产物的DGGE图谱分析和阳性克隆序列分析及进化树的建立  102
    3 结果与分析  102-105
      3.1 PCR反应及产物的琼脂糖检测  102-103
      3.2 肠道细菌基因组16S rDNA序列分析  103
      3.3 优势菌进化树分析  103-105
    4 讨论  105-107
    5 小结  107-109
  第六章 ERIC-PCR技术研究感染小鹅瘟病毒后鹅消化道杆菌菌群结构多样性的动态变化规律  109-121
    1 试验材料  109-110
      1.1 种毒、试验鹅及试剂  109-110
      1.2 主要仪器  110
      1.3 主要试剂的配制  110
    2 试验方法  110-112
      2.1 试验动物和样品采集及处理方法  110-111
      2.2 细菌总DNA的抽提  111
      2.3 引物合成  111
      2.4 ERIC-PCR的反应体系和反应条件  111
      2.5 肠道菌群ERIC-PCR的检测分析  111
      2.6 ERIC-PCR图谱分析  111-112
    3 结果与分析  112-117
      3.1 临床健康鹅各肠段杆菌菌群ERIC-PCR结构特征  112-113
      3.2 注射感染GPVCH_V株鹅各肠段杆菌菌群ERIC-PCR结构特征  113-114
      3.3 滴鼻感染GPVCH_V株鹅各肠段杆菌菌群ERIC-PCR结构特征  114-115
      3.4 口服感染GPVCH_V株鹅各肠段杆菌菌群ERIC-PCR结构特征  115-117
    4 讨论  117-119
      4.1 肠道杆菌菌群结构多样性ERIC-PCR的研究方法  117-118
      4.2 肠道内正常杆菌菌群的分布及其稳定性  118
      4.3 GPVCH_V株感染鹅肠道杆菌菌群结构的演替规律  118-119
    5 小结  119-121
  第七章 FQ-PCR对小鹅瘟病毒不同途径感染鹅消化道内4种代表菌数量变化规律的解析  121-144
    1 试验材料  122-123
      1.1 试验动物和样品采集及处理方法  122
      1.2 毒株及菌株  122
      1.3 实验仪器及试剂  122-123
      1.4 实验试剂的配制  123
    2 试验方法  123-129
      2.1 样品中菌群总DNA模板的提取  123
      2.2 标准菌株的培养  123-124
      2.3 标准菌株基因组的提取  124
      2.4 引物与探针的设计  124-127
        2.4.1 大肠杆菌属的引物与探针  124-125
        2.4.2 双歧杆菌的引物与探针  125-126
        2.4.3 乳酸杆菌属的引物与探针  126
        2.4.4 芽孢杆菌属的引物与探针  126-127
      2.5 标准品制备所用引物  127
      2.6 标准品的制备及鉴定  127-128
      2.7 实时荧光定量PCR标准曲线的建立及线性范围的确定  128-129
        2.7.1 大肠杆菌属  128
        2.7.2 双歧杆菌属  128
        2.7.3 乳酸杆菌属  128-129
        2.7.4 芽孢杆菌属  129
      2.8 实时荧光定量PCR解析各样品中特定菌属菌群结构  129
    3 结果与分析  129-139
      3.1 标准品制备与鉴定  129-131
        3.1.1 大肠杆菌属常规PCR产物  129-130
        3.1.2 双歧杆菌、芽孢杆菌属常规PCR产物  130-131
        3.1.3 乳酸杆菌属常规PCR产物  131
      3.2 标准曲线  131-135
        3.2.1 大肠杆菌属FQ-PCR标准曲线  131-132
        3.2.2 双歧杆菌属FQ-PCR标准曲线  132-133
        3.2.3 乳酸杆菌属FQ-PCR标准曲线  133-134
        3.2.4 芽孢杆菌属FQ-PCR标准曲线  134-135
      3.3 实时荧光定量PCR(FQ-PCR)对鹅消化道内菌群的定量检测  135-139
        3.3.1 FQ-PCR对鹅消化道内大肠杆菌属菌群的定量检测  135
        3.3.2 FQ-PCR对鹅消化道内双歧杆菌属菌群的定量检测  135-138
        3.3.3 FQ-PCR对鹅消化道内乳酸杆菌属菌群的定量检测  138
        3.3.4 FQ-PCR对鹅消化道内芽孢杆菌属菌群的定量检测  138-139
    4 讨论  139-142
      4.1 FQ-PCR对细菌在机体内增殖分布规律研究的优越性  139
      4.2 消化道内正常菌群的分布及其生理意义  139-140
      4.3 GPV感染鹅消化道菌群数量的变化  140-142
    5 小结  142-144
第三部分 结论  144-145
参考文献  145-165
致谢  165-166
附件材料  166-170
作者简介  170
攻读学位期间发表的学术论文目录  170

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