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间接原位PCR检测GPV方法建立及GPV在实验感染雏鹅体侵染规律的研究

作　者: 范波
导　师: 汪铭书；程安春
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 小鹅瘟病毒 间接原位PCR 动态分布规律 雏鹅
分类号: S858.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 22次
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内容摘要


根据Zadori报道的小鹅瘟病毒(GPV)全基因序列,针对高度保守性的GPV-VP3基因核苷酸序列用Oligo软件设计一对引物,经液相PCR扩增出了预期长度为441bp的片段。在此扩增片段范围内,应用Oligo软件设计长度为34bp的寡核苷酸探针,建立了能特异的从感染雏鹅组织石蜡切片中检测出小鹅瘟病毒核酸的间接原位PCR方法。将小鹅瘟病毒通过口服、滴鼻、肌肉注射三个途径感染7日龄雏鹅,同时设置同居组和对照组,攻毒后在不同时间点分别采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠、胸腺、哈氏腺、法氏囊、大脑、食道、气管等组织,应用建立的间接原位PCR方法检测小鹅瘟病毒在雏鹅体内的动态分布规律。结果表明:1.建立了间接原位PCR从石蜡切片中检测小鹅瘟病毒的方法。通过对引物特异性检测,探针特异性和敏感性检测,液相PCR对结果的验证以及相关文献支持,证明该方法特异性强、灵敏度高,并且能在组织细胞水平定位核酸。同时根据斑点杂交结果计算出探针可检测约16.25pg的同源DNA。2.应用建立的间接原位PCR方法检测小鹅瘟病毒在雏鹅体内的动态分布规律,结果表明不同感染途径GPV侵染机体的顺序不一致:①口服组在攻毒后4h,即可在食道中检测到GPV DNA,而其它组织在攻毒后12h检测到GPV DNA。GPV DNA含量随攻毒时间的增加逐渐增加,其中肝脏、脾脏、法氏囊、肺脏、大脑、哈氏腺GPV DNA含量较高。②肌肉注射组在攻毒后4h可在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、法氏囊、胸腺、哈氏腺检测到大量GPV DNA,而其它组织在12h后才能检测到大量GPV DNA。③滴鼻组在攻毒后4h可在气管检测到GPV DNA,12h后在其它组织检测到GPV DNA,其含量与口服攻毒组相当。④口服同居组攻毒后48h可在食道检测到GPV DNA,72h后可在其它组织检测到GPV DNA。⑤滴鼻同居组攻毒后72h可在食道检测到GPV DNA,9d后才能在其它组织检测到GPV DNA。⑥肌肉注射同居组检测结果与滴鼻同居组结果相同。3.根据同居检测结果分析发现,三个同居组GPV最先感染的组织器官都是食道,检测结果与口服攻毒组检测结果相同。可以推测,小鹅瘟病毒在本实验同居组中可能是通过饮水、食物、粪便、分泌物等途径进入口腔感染雏鹅机体。

全文目录


中文摘要  4-5
Abstract  5-11
第一部分 文献综述  11-19
  1 小鹅瘟病理学特征  11-12
  2 小鹅瘟病毒生物学研究进展  12-16
    2.1 GPV一般生物学特征  12
    2.2 GPV分子生物学特征  12-14
      2.2.1 GPV基因结构  12-13
      2.2.2 GPV结构蛋白  13-14
      2.2.3 GPV非结构蛋白  14
    2.3 GPV分子生物学研究进展  14-15
    2.4 GPV常规检测方法  15-16
  3 原位PCR技术  16-18
    3.1 原位PCR主要方法  17-18
    3.2 原位PER在病理学研究中的应用  18
  4 研究目的与意义  18-19
第二 实验研究  19-41
  1 材料与方法  19-31
    1.1 材料  19-24
      1.1.1 实验动物  19
      1.1.2 毒株  19
      1.1.3 主要实验仪器  19-20
      1.1.4 主要试剂  20
      1.1.5 溶液配制  20-24
    1.2 动物实验设计  24
      1.2.1 实验动物分组  24
      1.2.2 实验材料的采集  24
      1.2.3 实验材料的固定  24
    1.3 间接原位PCR检测小鹅瘟病毒方法的建立  24-31
      1.3.1 引物及探针设计  24-25
      1.3.2 引物特异性实验  25
      1.3.3 探针特异性实验  25-26
      1.3.4 探针敏感性实验  26
      1.3.5 组织切片消化反应条件的优化  26-27
      1.3.6 探针浓度优化  27
      1.3.7 材料的预处理  27-28
      1.3.8 原位PCR扩增  28
      1.3.9 原位杂交  28
      1.3.10 杂交后洗涤  28-29
      1.3.11 杂交后显色  29
      1.3.12 结果判定  29
      1.3.13 间接原位PCR结果的验证  29-31
  2 实验结果  31-36
    2.1 间接原位PCR反应条件的优化结果  31-34
      2.1.1 引物特异性实验结果  31-32
      2.1.2 探针特异性实验结果  32
      2.1.3 探针敏感性实验结果  32-33
      2.1.4 组织切片消化优化实验结果  33
      2.1.5 探针浓度优化实验结果  33-34
      2.1.6 间接原位PCR结果的验证结果  34
    2.2 间接原位PCR检测结果  34-36
      2.2.1 攻毒组检测结果  34-35
      2.2.2 同居组检测结果  35
      2.2.3 对照组检测结果  35-36
  3 讨论  36-41
    3.1 间接原位PCR方法的建立和优化  36-39
      3.1.1 间接原位PCR方法的选择  36
      3.1.2 组织切片优化  36-37
      3.1.3 引物和探针优化  37-38
      3.1.4 反应条件优化  38-39
    3.2 小鹅瘟病毒在小鹅体内动态分布规律的探讨  39-40
    3.3 间接原位PCR技术的优势、存在问题及展望  40-41
第三部分 结论  41-42
第四部分 参考文献  42-47
致谢  47-48
附录  48-58

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家禽 > 鹅
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