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家蚕丝腺生物反应器表达hGM-CSF转基因载体的构建及应用研究

作　者: 周文林
导　师: 贡成良
学　校: 苏州大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 家蚕 转基因 生物反应器 piggyBac转座子 转基因载体
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


家蚕(Bombyx mori),又名桑蚕,属鳞翅目家蚕蛾科,是迄今为止数百万种昆虫中仅有的被驯化并大规模人工饲养的经济昆虫。其幼虫具有一对发达的绢丝腺,能够大量合成分泌丝蛋白。近几年,以转基因家蚕表达外源蛋白的技术体系正被逐步建立。但现有的技术体系存在外源基因表达量不高,筛选工作量大等问题。本研究以丝蛋白基因启动子构建新的基于piggyBac转座子的家蚕转基因载体。克隆丝素蛋白重链基因(fibroin heavy chain,fib-H)、轻链基因(fibroin light chain,fib-L)启动子,并以生物信息学手段分析启动子元件;构建fib-H、fib-L启动子控制红色荧光蛋白(Discosoma red fluorescent protein,DsRed/drFP583)报告基因的瞬时表达载体,进行家蚕体内及BmN培养细胞中的瞬时表达试验;构建分别以fib-H、fib-L启动子控制外源基因的转基因载体;以piggyBac转座子介导进行家蚕培养细胞的转基因研究;以构建完成的转基因载体初步进行家蚕转基因研究。研究结果获得了fib-H启动子(EF540776,489 bp)、fib-L启动子(EF540777,606 bp),fib-L来源的polyA加尾信号序列(EF216676,289 bp),fib-L第一内含子来源的增强子序列(enhancer)(DQ679478,375 bp),新霉素抗性基因(neomycin resistance gene,neo~r)等元件;瞬时表达证明克隆的启动子在家蚕后部丝腺组织具有特异性活性,同时发现其在家蚕卵巢来源的BmN培养细胞中亦具有一定的活性;以克隆的元件构建二种新的转基因载体,除了已有的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)报告基因外,载体中包括分别以fib-n、fib-L启动子控制外源功能基因hGM-CSF(humangranulocyte-macrophage colony stimulating factor,粒/巨噬细胞集落刺激因子)并带有polyA加尾信号的表达元件、促进转录活性的增强子元件、可与GFP进行双重筛选的neo~r基因表达元件;以带有neo~r基因表达元件和GFP报告基因的piggyBac转座子载体转化家蚕BmN细胞,以终浓度800μg/mL的G418(Geneticin)筛选3个月,获得稳定转化细胞,呈现绿色荧光细胞数约75%,PCR鉴定证实细胞基因组DNA中外源基因的存在;构建的转基因载体初步进行家蚕转基因试验,幼虫2龄3 d观察到3条蚕体表具有绿色荧光斑点,蛹期观察到3个表现明显绿色荧光的个体。本研究构建的转基因载体可促进转基因家蚕生物反应器生产外源蛋白的深入研究。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-12
第一章 家蚕生物反应器研究进展(文献综述)  12-43
  第一节 家蚕杆状病毒表达系统  12-19
    1 引言  12
    2 杆状病毒表达系统的建立及其原理  12-13
    3 几种可高效表达外源基因的转移载体  13-14
      3.1 多元表达载体  13
      3.2 融合表达载体  13
      3.3 便于纯化表达产物的转移载体  13-14
    4 重组病毒筛选鉴定方法的改进  14
    5 影响表达水平的因素  14-15
      5.1 启动子种类及启动子序列的完整性  14-15
        5.1.1 多角体基因(polh)启动子  14
        5.1.2 p10基因启动子  14
        5.1.3 其它晚期启动子  14
        5.1.4 嵌合修饰启动子  14-15
        5.1.5 IE-1启动子  15
        5.1.6 宿主昆虫和非杆状病毒启动子  15
      5.2 外源蛋白的性质  15
      5.3 其它因素  15
    6 总结与展望  15-16
    参考文献  16-19
  第二节 转基因家蚕生物反应器研究  19-43
    1 引言  19
    2 家蚕转基因体系研究  19-33
      2.1 家蚕转基因研究的早期探索  19-21
      2.2 家蚕转基因研究的深入发展  21-25
        2.2.1 显微注射法  21-22
        2.2.2 扎卵法  22
        2.2.3 脉冲场电泳法  22
        2.2.4 基因枪喷射导入法  22-23
        2.2.5 压力渗透法  23
        2.2.6 电穿孔法  23-24
        2.2.7 精子介导基因转移法  24-25
        2.2.8 重组病毒介导法  25
      2.3 家蚕转基因技术体系的建立  25-33
        2.3.1 基于转座子介导的家蚕转基因技术体系的建立  25-26
        2.3.2 家蚕转基因常用载体  26-33
          2.3.2.1 基于转座子的转基因载体  26-31
          2.3.2.2 基因打靶载体  31-33
    3 家蚕转基因技术的应用  33-36
      3.1 基础研究  33-34
      3.2 基于转基因双元系统控制基因表达  34
      3.3 转基因RNAi提高家蚕抗性  34-35
      3.4 转基因家蚕生物反应器研究  35-36
    4 转基因家蚕生物反应器现存问题  36-38
      4.1 已表达的外源基因  36
      4.2 外源基因的表达形式  36-37
      4.3 表达部位  37
      4.4 适合于转基因家蚕生物反应器的品种  37
      4.5 转基因载体  37
      4.6 外源基因表达水平  37-38
    5 总结与展望  38
    参考文献  38-43
第二章 研究目的与内容  43-45
  1 目的与意义  43
  2 研究内容  43-45
第三章 主要试剂与常用实验方法  45-50
  1 常用试剂  45-47
  2 主要仪器设备  47
  3 常用实验方法  47-50
第四章 构建转基因载体所需元件的克隆  50-90
  第一节 fib-H、fib-L启动子元件的克隆及序列分析  50-63
    1 引言  50-51
    2 材料与方法  51-52
      2.1 实验材料  51
      2.2 实验方法  51-52
    3 结果与分析  52-60
      3.1 重组载体的酶切鉴定  52-54
      3.2 fib-H启动子分析  54-57
        3.2.1 fib-H启动子序列分析  54-56
        3.2.2 fib-H启动子序列单链二级结构分析  56-57
      3.3 fib-L启动子分析  57-60
        3.3.1 fib-L启动子序列分析  57-59
        3.3.2 fib-L启动子序列单链二级结构分析  59-60
    4 讨论  60-61
    参考文献  61-63
  第二节 fib-H、fib-L启动子的活性分析  63-75
    1 引言  63
    2 材料与方法  63-68
      2.1 实验材料  63-64
      2.2 实验方法  64-68
    3 结果与分析  68-70
      3.1 重组载体pSK-FH-DsRed-PolyA酶切鉴定  68
      3.2 重组载体pSK-FL-DsRed-PolyA酶切鉴定  68
      3.3 DsRed报告基因的序列测定  68
      3.4 polyA加尾信号的序列测定  68-69
      3.5 fib-H、fib-L启动子控制DsRed基因在家蚕BmN细胞中的瞬时表达  69-70
      3.6 fib-H、fib-L启动子控制DsRed基因在家蚕丝腺组织中的瞬时表达  70
        3.6.1 不同品种家蚕丝腺荧光背景调查  70
        3.6.2 重组载体在丝腺组织中的瞬时表达  70
    4 讨论  70-73
    参考文献  73-75
  第三节 fib-H、fib-L启动子控制hGM-CSF的载体构建  75-82
    1 引言  75
    2 材料与方法  75-79
      2.1 实验材料  75-76
      2.2 实验方法  76-79
    3 结果与分析  79-80
      3.1 hGM-CSF基因序列测定  79
      3.2 hGM-CSF表达载体的酶切鉴定  79-80
        3.2.1 重组载体pSK-FH-GMCSF-PolyA的酶切鉴定  79-80
        3.2.2 重组载体pSK-FL-GMCSF-PolyA的酶切鉴定  80
    4 讨论  80-81
    参考文献  81-82
  第四节 piggyBac转座子载体的改造  82-90
    1 引言  82
    2 材料与方法  82-86
      2.1 实验材料  82-83
      2.2 实验方法  83-86
    3 结果与分析  86-88
      3.1 pigA3-Neo载体的鉴定  86
      3.2 pigA3GFP-Neo-En载体的鉴定  86-88
    4 讨论  88
    参考文献  88-90
第五章 转基因载体的构建  90-98
  1 引言  90
  2 材料与方法  90-94
    2.1 实验材料  90-91
    2.2 实验方法  91-94
  3 结果与分析  94-96
    3.1 基于fib-H启动子的转基因载体鉴定  94-95
      3.1.1 酶切鉴定  94
      3.1.2 PCR鉴定  94-95
    3.2 基于fib-L启动子的转基因载体鉴定  95-96
      3.2.1 酶切鉴定  95-96
      3.2.2 PCR鉴定  96
  4 讨论  96-97
  参考文献  97-98
第六章 piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究  98-108
  1 引言  98
  2 材料与方法  98-102
    2.1 实验材料  98-99
    2.2 实验方法  99-102
  3 结果与分析  102-105
    3.1 转基因载体的鉴定  102-103
    3.2 转化细胞的筛选  103-104
    3.3 转化细胞的PCR鉴定  104
    3.4 转化细胞的SDS-PAGE分析  104-105
    3.5 插入位点分析  105
  4 讨论  105-106
  参考文献  106-108
第七章 家蚕转基因研究初探  108-113
  1 引言  108
  2 材料与方法  108-109
    2.1 实验材料  108
    2.2 实验方法  108-109
  3 结果与分析  109-111
    3.1 孵化率调查  109-110
    3.2 G0代幼虫初步筛选  110
    3.3 G0代蛹初步筛选  110-111
  4 讨论  111-112
  参考文献  112-113
结论  113-114
  1 主要结论与创新点  113
  2 尚待进一步研究的问题  113-114
附录1:文中所用缩略语  114-115
附录2:在学期间科研情况  115-116
后记  116

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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