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TaClo对体外培养大鼠中脑腹侧多巴胺能神经元的毒性作用的研究

作　者: 杜鑫瑞
导　师: 滕良珠；孙为群
学　校: 山东大学
专　业: 外科学
关键词: 多巴胺能神经元体外培养 TaClo 毒性作用 Caspase-3 凋亡
分类号: R742.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景Bringmann等于1995年发现1-三氯甲基-1,2,3,4-四氢化-β-咔啉(TaClo)。TaClo是三氯乙烯在体内代谢的产物。20世纪初,三氯乙烯曾作为驱虫剂、麻醉剂和人工流产剂而应用很长时间,在工业上则作为溶剂、清洗剂等广泛应用到现在。近年来发现,长时间地接触较低浓度的TCE可对暴露者的神经行为功能产生很大的影响,主要表现在注意力和短时记忆力降低,手运动迟缓,手-眼运动稳定性和协调性差等神经退行性改变。TaClo在体内主要分布于肾脏、肝脏和脑。由于TaClo的分子结构与对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)的相似,而且易于蓄积在脑中,其在中枢神经功能退行性疾病中的作用逐渐引起了广泛的关注。美国肯塔基大学Don Gash等在一项帕金森病的临床试验中发现,长时间接触TCE可增加患帕金森综合症的风险。目的完善高效的多巴胺能神经元原代培养方法；研究TaClo对体外培养的多巴胺能神经元凋亡中的作用及其机制。方法取孕14天SD大鼠,乙醚麻醉后,常规腹部消毒开腹,取出子宫,取出胚胎,置显微镜下剥离外膜,切取中脑腹侧部分,0.1%胰蛋白酶37℃水浴消化。胎牛血清终止消化。玻璃移液管反复轻柔吹打,再用10μl移液枪头吹打数次。离心后弃上清液,加入含血清DMEM/F12细胞培养液。细胞计数板进行计数,调整细胞浓度为每30μl细胞悬液1×105个细胞,每孔301μl微岛法接种于预先多聚赖氨酸包被的24孔培养板中。静置于5%C02培养箱中,37℃培养1小时。待细胞贴壁后,加入500μl完全培养基培养。继续培养7天至细胞成熟,即为神经元-胶质细胞混合培养。原代神经元培养方法同上,接种24小时后加阿糖胞苷作用48小时。在倒置显微镜下观察细胞形态,多巴胺能神经元TH染色计数。分别用不同浓度的TaClo(50、100、200、500、1000μmol/L)对原代神经元-胶质细胞混合培养和原代神经元培养的中脑腹侧多巴胺能神经元细胞进行干预,作用72小时后在倒置显微镜下观察细胞形态,细胞TH免疫细胞化学染色后多巴胺能神经元计数；分别用终浓度为50和200μmol/L的TaClo干预原代神经元-胶质细胞混合培养的细胞,作用1小时、24小时后,Western-blot法测Caspase-3蛋白表达。利用统计学软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学分析。结果培养7天后在倒置显微镜下观察见细胞核大,胞核清亮,卵圆形或圆形,核膜清晰,核仁可见,胞质透亮,胞体多形性,有较多突起,突起之间相互联系。TH免疫细胞化学染色后,呈棕褐色,胞体轴突清晰较长的为多巴胺能神经元。TaClo作用后多巴胺能神经元数量明显下降,50μmol/L浓度的TaClo诱发40%的多巴胺能神经元死亡；当TaClo浓度为200μmol/L时,接近90%的多巴胺能神经元死亡(P<0.01 and P<0.001); TaClo (50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)诱导的多巴胺能神经元死亡具有明显的剂量依赖性,结果有显著性差异(P<0.001)。Western-blot显示：TaClo作用的2个时间点,Caspase-3表达均增高,表达具有药物剂量依赖性。结论TaClo可以导致多巴胺能神经元的凋亡,这一过程是通过活化的caspase-3蛋白表达等通路完成的。

全文目录

中文摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
符号说明  11-12
前言  12-15
材料和方法  15-22
结果  22-23
讨论  23-26
结论  26-27
附图表  27-30
参考文献  30-32
文献综述  32-50
  综述参考文献  40-50
致谢  50-51
攻读学位期间发表的或待发表的学术论文目录  51-52
学位论文评阅及答辩情况表  52

TaClo对体外培养大鼠中脑腹侧多巴胺能神经元的毒性作用的研究

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