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腺苷通过内质网应激诱导食管癌EC109细胞凋亡

作　者: 韦碧柳
导　师: 吴灵飞
学　校: 汕头大学
专　业: 内科学
关键词: 腺苷细胞凋亡内质网应激食管癌EC109细胞
分类号: R735.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究目的:探讨内质网应激在腺苷（adenosine）诱导EC109细胞凋亡中的作用及其分子机制。方法:EC109细胞培养后按以下方法进行实验,（1）四氮唑蓝检测法（MTT）:腺苷2 mmol L^-1作用于EC109细胞不同时间（24～72 h）及将EC109细胞暴露于不同浓度腺苷(0.5～4 mmol L^-1)作用36 h,四氮唑蓝检测法观察腺苷对EC109细胞生存率的时效和量效关系。（2）原位末端转移酶标记技术（TUNEL）:不同浓度腺苷(0.5～4 mmol L^-1)处理EC109细胞36 h ,原位末端转移酶标记技术检测细胞凋亡情况（3）免疫荧光染色法:细胞贴壁后加入正常培养基（空白组和对照组）或含腺苷2.0 mmol L^-1培养基（腺苷处理组）处理细胞36 h,免疫荧光观察腺苷2.0 mmol L^-1作用前后内质网应激相关蛋白（GRP78、Caspase-4、Caspase-3、CHOP）的表达及亚细胞定位。（4）免疫印迹法（Western blotting）:细胞传代至培养瓶,24 h后分别加入含不同浓度腺苷(0.5～4 mmol L^-1)的培养基处理36 h,提取细胞总蛋白质,免疫印迹法检测细胞内质网应激相关蛋白（GRP78、Caspase-4、CHOP）及NF-κB和凋亡执行者Caspase-3分子的表达情况。结果:1、腺苷2 mmol L^-1与EC109细胞作用24,36,48和72 h,细胞存活率分别为（57.7 15.0）%,（56.5 11.1）%,（43.8 5.7）%和（28.8 4.1）%,呈时间依赖性下降（r=0.9192,P<0.01）。不同浓度腺苷(0.5,1,2和4 mmol L^-1)处理EC109细胞36 h,随药物浓度增加,细胞存活率依次为（83.14 11.2）%,（67.86 6.72）%,（55.31 5.01）%和（45.39 5.45）%,呈剂量依赖性降低（r=0.8252,P<0.01）。2、腺苷0.5～4 mmol L^-1处理EC109细胞36 h,细胞凋亡率分别为（15.5 1.1）%,（28.2 0.8）%,（40.1 2.2）%和（50.6 1.3）%,与对照组（2.1 0.3）%相比均明显增加（r =0.874,P<0.05）3、腺苷2 mmol L^-1与EC109细胞作用36 h,免疫荧光法检测结果表明,对照组EC109细胞胞浆中出现GRP78的表达,腺苷处理组表达增多;Caspase-4,Caspase-3和CHOP在对照组EC109细胞胞浆中无表达,提示EC109细胞经腺苷处理后Caspase-4,Caspase-3和CHOP蛋白出现表达并发生核移位4、Western blotting结果表明GRP78, Caspase-4, Caspase-3, CHOP和NF-κB表达量呈剂量依赖性增加（rGRP78=0.9471, rCaspase-4=0.8977,rCaspase-3=0.968, rCHOP=0.9762, rNF-κB=0.9471, P<0.05）。结论:1、腺苷能诱导EC109细胞凋亡,与我们既往的对HepG2细胞研究结果一致。2、在腺苷诱导EC109细胞凋亡过程中,内质网应激相关蛋白GRP78、Caspase-4、Caspase-3、CHOP、NF-κΒ的表达明显升高Caspase-4、Caspase-3、CHOP发生明显核易位从胞浆转移进入胞核内,表明内质网应激通路被活化,EC109细胞凋亡与内质网应激途径可能有关。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-7
缩略词简表  7-11
第一章前言  11-14
  1.1 研究背景  11-13
  1.2 研究课题的基金来源  13
  1.3 研究课题的目的和意义  13
  1.4 研究内容  13-14
第二章材料及方法  14-31
  2.1 实验材料  14-17
    2.1.1 细胞株  14
    2.1.2 药品与试剂  14-15
    2.1.3 主要仪器  15-17
  2.2 技术路线  17-19
    2.2.1 腺苷对 EC109 细胞增殖的影响  17
    2.2.2 TUNEL 检测细胞凋亡  17-18
    2.2.3 腺苷对 EC109 细胞内质网应激及凋亡相关蛋白表达的影响  18-19
  2.3 实验方法  19-31
    2.3.1 细胞的复苏  19
    2.3.2 细胞传代  19-20
    2.3.3 细胞的冻存  20-21
    2.3.4 MTT 细胞活力测定  21-22
    2.3.5 TUNEL 检测细胞凋亡  22-24
    2.3.6 免疫荧光染色  24-26
    2.3.7 Western blotting 检测蛋白表达情况  26-31
第三章结果与分析  31-36
  3.1 腺苷对 EC109 细胞增殖的影响  31-32
  3.2 腺苷诱导 EC109 细胞凋亡  32-34
  3.3 腺苷诱导 GRP78、CHOP 和 Caspase-3 及4 的亚细胞分布的改变  34
  3.4 腺苷对 GRP78、CHOP、NF-κB、Caspase-3 及4 蛋白表达的影响  34-36
第四章讨论  36-37
参考文献  37-41
文献综述  41-49
  参考文献  45-49
附录  49-51
致谢  51-52
发表论文情况  52-53
个人简介  53

腺苷通过内质网应激诱导食管癌EC109细胞凋亡

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