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PiggyBac转座子介导外源基因在猪成纤维细胞及胚胎中表达研究

作　者: 罗一博
导　师: 夏平
学　校: 东北农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: piggyBac 猪转基因核移植 follistatin
分类号: S828
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

转基因动物是指以实验方法导入外源基因,在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。转基因动物有非常重大的生产和科研作用。转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具,如研究基因的结构与功能的关系,细胞发育的潜能性,细胞核与细胞质的相互关系,胚胎发育调控,肿瘤,神经与发育等;并可以用来建立多种疾病的动物模型,进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法;还能提高动物育种效率。另外转基因动物可作为医用或食用蛋白的生物反应器。但是目前转基因动物的生产也遇到了一些问题,比如利用质粒的随机整合得到的转基因动物在传代过程中会出现外源基因的丢失,位置效应和甲基化的影响会造成外源基因表达效率的下降;病毒感染体系中病毒滴度和随之产生的辅助病毒限制了其在临床和生产上的应用,因此,寻找到一个合适的转基因载体是转基因动物生产的重要环节。本研究利用来自鳞翅目昆虫的piggyBac转座子作为转基因载体,将外源基因(EGFP和Follistatin)导入到猪的胎儿成纤维细胞,并将携带转座子的转基因细胞作为核移植供体细胞进行核移植,得到转基因的猪核移植胚胎,系统的评价了piggyBac转座子作为转基因载体在猪的转基因生产中的优缺点,为piggyBac转座子应用于猪的转基因生产奠定基础。本研究得到的实验结果如下:1细胞分别转染piggyBac转座子体系和pEGFP-C1随机整合体系,两个转染体系在12小时和48小时的时候,EGFP的表达没有差异,但是在转染24小时的时候,随机整合体系的EGFP表达比piggyBac转座子体系EGFP表达高,而且差异显著。2细胞筛选10天后,进行形成的细胞集落计数,并将计数结果进行统计分析,来表示两种不同转染体系的稳定转染效率。结果发现piggyBac转座子体系得到的细胞集落数是pEGFP-C1体系得到的细胞集落数的18倍,差异显著。3利用基因组步移技术检测了piggyBac转座子5’端旁侧序列。测序结果显示,所有的转座子片段都是以转座的方式整合到基因组上的,插入的都是TTAA四核苷酸位点,没有发现随机整合的现象。4将基因组步移得到的片段和猪的基因组进行比对,以验证piggyBac转座子的插入位点信息。由于目前猪的基因组全序列还不完整,还无法完全得知这些片段的插入位点,但是仍然在猪的2,9,15号染色体上发现了同源序列。5为了检测piggyBac转座子介导的外源基因在猪基因组上的拷贝数,利用southern blot检测外源基因的拷贝数。结果表明转座子可以介导外源基因在猪基因组上的多拷贝整合。6为了检测转座和随机整合两种方式得到的转基因细胞中外源基因的表达量,Real-Time PCR用来检测两种细胞中外源基因的表达。结果表明,piggyBac转座子能高效的介导外源基因在猪体细胞中的表达,且表达量是随机整合法的4倍。7为了检测两种细胞中外源基因的表达量差异是否和启动子的甲基化有差异,我们分析了细胞传代过程中外源基因启动子CMV的甲基化变化。结果发现两种细胞中外源基因启动子的甲基化情况没有改变。8不同比例的、的转座子供体质粒和辅助质粒转染细胞并G418筛选10天后,统计每一组得到的阳性细胞集落数。结果发现,当供体质粒和辅助质粒的比例在1:4之前时,阳性细胞集落数随辅助质粒量得增加而增加,但当该比例到1:5的时候,阳性细胞集落数显著下降。9为了检测piggyBac转座酶对猪胎儿成纤维细胞增殖造成的影响,用CCK-8试剂盒检测不同量得转座酶对细胞增殖的影响。结果表明piggyBac转座酶影响猪胎儿成纤维的增殖,尤其是当转座酶和pEGFP-C1质粒共转染细胞时,细胞的增殖效率显著下降。10携带有piggyBac转座子和pEGFP-C1随机整合的细胞作为核移植的供体细胞进行核移植后,检测核移植胚胎的卵裂率,囊胚率和囊胚细胞数。结果表明,无论是piggyBac转座还是pEGFP-C1的随机整合,核移植胚胎的卵裂率,囊胚率和囊胚细胞数都没有显著差异。表明piggyBac转座不影响核移植胚胎的发育。11为了比较两种转染体系在核移植胚胎中是否能有效介导外源基因的表达,利用Real-Time PCR检测了两种供体细胞来源的核移植胚胎中的外源基因EGFP的表达,结果表明piggyBac转座子能高效介导外源基因的表达,而且表达量是随机整合体系介导的外源基因表达量得17倍。12在转基因细胞的生长过程中,follistatin表达的猪胎儿成纤维细胞发生了形态上的改变,细胞变长变细,并且可以呈克隆状生长。Follistatin的表达引起了猪胎儿成纤维细胞克隆样的生长和其他形态上的变化,所以我们用Real-Time PCR检测了表达follistatin的猪胎儿成纤维细胞中p53和desmin的表达,结果表明,p53和desmin的表达量都上升。

全文目录

摘要  11-13
Abstract  13-15
1 前言  15-38
  1.1 转基因载体的分类和特征  15-19
    1.1.1 质粒载体  15-17
    1.1.2 真核病毒载体  17-19
  1.2 转座子的分类和研究进展  19-24
    1.2.1 DNA 转座子  20-21
    1.2.2 常见的DNA 转座子种类  21-23
    1.2.3 RNA 转座子  23-24
  1.3 PiggyBac 转座子研究进展  24-29
    1.3.1 PiggyBac 转座子的结构  25
    1.3.2 PiggyBac 转座子的转座机制  25-27
    1.3.3 PiggyBac 转座子的应用  27-29
    1.3.4 甲基化修饰降低piggyBac 的转座效率  29
  1.4 绿色荧光蛋白研究进展  29-32
    1.4.1 绿色荧光蛋白结构和发光原理  29-30
    1.4.2 绿色荧光蛋白在生物技术中的应用  30-32
  1.5 Follistatin 的结构和功能  32-37
    1.5.1 Follistatin 的结构  32-34
    1.5.2 Follistatin 的生物学作用  34-37
  1.6 本研究的目的和意义  37-38
2 材料与方法  38-53
  2.1 实验材料  38-41
    2.1.1 实验动物和质粒  38
    2.1.2 工具酶及试剂盒  38-39
    2.1.3 主要试剂  39-40
    2.1.4 主要仪器设备  40
    2.1.5 主要生物学分析软件  40-41
  2.2 实验方法  41-52
    2.2.1 猪成纤维细胞的分离培养  41
    2.2.2 载体的构建  41-42
    2.2.3 感受态细胞制备和转化  42-43
    2.2.4 质粒提取  43-44
    2.2.5 细胞转染  44
    2.2.6 DNA 和RNA 提取以及cDNA 获得  44-45
    2.2.7 基因组步移  45-46
    2.2.8 CCK8 检测  46-47
    2.2.9 Southern blot  47-49
    2.2.10 亚硫酸氢盐测序  49-50
    2.2.11 RealTime PCR  50-51
    2.2.12 卵母细胞培养和核移植  51-52
    2.2.13 流式细胞术  52
  2.3 主要的生物信息学网站  52-53
3 实验结果  53-75
  3.1 PiggBac 转座子二元载体构建  53-57
    3.1.1 PiggyBac 转座子供体质粒构建结果  53-55
    3.1.2 PiggyBac 转座子辅助质粒构建结果  55-57
  3.2 PiggyBac 转座子载体转染细胞结果  57-59
    3.2.1 PiggyBac 转座子二元载体不影响质粒的跨膜  57-58
    3.2.2 PiggyBac 转座子的稳定转染效率高于随机整合体系  58-59
  3.3 PiggyBac 转座子在猪基因组上的转座特征  59-65
    3.3.1 外源基因稳定整合到猪基因组上  59-60
    3.3.2 PiggyBac 转座子插入TTAA 四核苷酸位点  60-62
    3.3.3 PiggyBac 转座子在基因组上多拷贝整合  62-64
    3.3.4 PiggyBac 转座不影响核移植胚胎的发育  64-65
  3.4 PiggyBac 转座子在细胞和胚胎中高效介导外源基因的表达  65-66
    3.4.1 PiggyBac 转座子介导EGFP mRNA 高效表达  65
    3.4.2 PiggyBac 转座子介导EGFP 蛋白的高效表达  65-66
  3.5 外源基因启动子的甲基化和外源基因表达量无关  66-67
  3.6 PiggyBac 转座酶的量影响转染和细胞增殖  67-69
    3.6.1 PiggyBac 转座酶的量对细胞转染的影响  67-69
    3.6.2 PiggyBac 转座酶的量对细胞增殖的影响  69
  3.7 PiggyBac 转座子介导Follistatin 在PFF 中的表达  69-75
    3.7.1 携带猪Follistatin 的piggyBac 转座子供体质粒构建  69-70
    3.7.2 细胞转染和筛选  70-71
    3.7.3 供体质粒过量导致随机整合现象  71-72
    3.7.4 Follistatin 的表达引起猪胎儿成纤维细胞中p53 和desmin 的表达变化  72-75
4 讨论  75-81
  4.1 质粒跨膜和转基因效率提高  75-76
  4.2 PiggyBac 转座的分子特征  76-78
    4.2.1 PiggyBac 转座子插入TTAA 四核苷酸位点  76
    4.2.2 PiggyBac 转座子在猪基因组上的多拷贝插入  76-77
    4.2.3 研究转座子插入位点的方法  77-78
  4.3 外源基因表达  78-79
    4.3.1 外源基因在猪胎儿成纤维细胞中的表达  78
    4.3.2 外源基因在猪核移植胚胎中的表达  78-79
  4.4 PiggyBac 转座酶对细胞的毒性  79-80
    4.4.1 PiggyBac 转座子的过表达抑制现象  79
    4.4.2 PiggyBac 转座酶对细胞增殖的影响  79-80
  4.5 Follistatin 在猪胎儿成纤维细胞中的表达  80-81
    4.5.1 Follistatin 使成纤维细胞出现向成肌细胞分化的趋势  80
    4.5.2 p53 在 follistatin 表达的成纤维细胞中维护细胞内的平衡  80-81
5 结论  81-82
致谢  82-83
参考文献  83-92
附录  92-94
攻读研究生期间发表的论文  94

PiggyBac转座子介导外源基因在猪成纤维细胞及胚胎中表达研究

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