学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

高分辨探针熔解曲线快速检测耐药结核分枝杆菌的研究

作　者: 崔运勇
导　师: 杨慧
学　校: 南昌大学
专　业: 免疫学
关键词: 结核分枝杆菌 耐药 探针熔解曲线 快速检测
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 33次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


研究背景：结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的疾病,它流行于世界各国家与地区,在经济欠发达地区情况尤甚。由于结核病病程长、患者依从性差,加上抗结核药物的不当使用,使MTB出现了耐药性问题并逐渐加剧,导致结核病近年来又重新成为受到广泛关注的公共卫生问题。传统的诊断方法如痰涂片、药敏试验的检出率低,周期长,因此快速检测与诊断耐药结核就成为了结核病防治的重要攻关方向。研究证实MTB耐药的主要原因是菌株的基因变异,耐利福平(Rifampicin, RFP)突变主要位于rpoB基因中的81bp片段,耐异烟肼(Isoniazid, INH)突变主要位于katG315、inhA启动子、ahpC启动子、inhA94等位点。高分辨熔解曲线分析(High-resolution melting,HRM)是近年出现的一种应用于单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)分析的技术,是一种操作简便、快速、低成本、结果准确,并实现了真正的闭管操作的检测方法。在本研究中,我们将HRM应用于MTB的耐药相关基因katG、inhA、ahpC、rpoB的检测。目的：通过HRM与基因测序分别检测MTB耐药基因katG、inhA、ahpC启动子区域和rpoB81bp核心区域的结果对比研究,探讨HRM快速检测耐药结核分枝杆菌的异烟肼与利福平耐药突变位点的可行性。方法：1.使用改良罗氏中性培养基转种菌株,对所培养的菌株进行INH与RFP的药物敏感性测定。2.将所有312株菌株进行katG、inhA、ahpC、rpoB基因目的片段的测序,运用blastn进行序列比对和分析。3.通过建立HRM方法,检测140株RFP耐药株rpoB中的81bp片段、150株INH耐药株katG315位、inhA启动子区、inhA94位、ahpC启动子区与rpoB8lbp核心区域,并与基因测序结果相比较,验证HRM在耐药结核分枝杆菌快速检测中的可行性。结果：1.RFP与INH基因测序的突变率分别为95.7%(134/140)、92%(138/150)。HRM检测RFP与INH的突变率分别为95.7%(134/140),88.1%(133/150)。基因测序与HRM检测结果差别无统计学意义(p>0.05)。2.140例RFP耐药株HRM检测与基因测序的阳性符合率为97.8%(131/134),150株INH耐药株中HRM检测与基因测序的阳性符合率为96.4%(133/138)3.HRM方法检测RFP的特异度为98.0%(150/153),灵敏度为93.6%(134/140),INH检测的特异度为98.7%(151/153),灵敏度为88.1%(133/150)。结论：1.与基因测序相比,HRM检测在应用于耐药MTB的快速检测时有同样的阳性检出能力,但更加简便、快速。2.与基因测序相比,HRM拥有良好的阳性符合率,但只能用于检测已知的突变位点。3.HRM在用于检测RFP与INH耐药MTB时有着良好的灵敏度和特异度。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第1章 引言  10-14
  1.1 概述  10-11
  1.2 MTB的耐药分子机制  11-12
  1.3 MTB检测方法的研究进展  12
  1.4 高分辨熔解曲线技术的研究进展  12-14
第2章 材料与方法  14-23
  2.1 材料  14
    2.1.1 研究对象  14
    2.1.2 材料与仪器  14
  2.2 方法及操作步骤  14-23
    2.2.1 菌株转种  15-18
    2.2.2 分枝杆菌药物敏感性测定  18-19
    2.2.3 DNA提取  19
    2.2.4 基因测序  19-20
    2.2.5 Real-time PCR扩增引物与HRM探针的设计与合成  20-21
    2.2.6 荧光实时定量PCR(real-time PCR)扩增与高分辨探针熔解曲线分析  21-22
    2.2.7 质量控制  22
    2.2.8 统计分析方法  22-23
第3章 结果  23-37
  3.1 菌株培养与药敏结果  23
  3.2 基因测序结果  23-30
    3.2.1 RFP测序结果  23-25
    3.2.2 INH测序结果  25-30
  3.3 HRM结果  30-34
    3.3.1 rpoB检测结果  31
    3.3.2 katG检测结果  31-32
    3.3.3 inhA检测结果  32
    3.3.4 ahpC检测结果  32
    3.3.5 质量控制结果  32-34
  3.4 探针熔解曲线检测耐药结核分枝杆菌结果的统计学分析  34-37
    3.4.1 特异度分析  35
    3.4.2 灵敏度分析  35-37
第4章 讨论  37-46
  4.1 药敏试验检测耐药结核分枝杆菌  37-38
  4.2 耐药结核分枝杆菌突变位点的选择  38-40
  4.3 探针熔解曲线应用于耐药MTB的快速检测  40-43
  4.4 探针熔解曲线的检测效率  43-46
第5章 结论  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-52
攻读硕士学位期的研究成果  52-53
综述  53-59
  参考文献  58-59

相似论文

  1. 61株鸭源鸡杆菌部分耐药基因及其与耐药性关系的研究,S852.61
  2. murA基因对分枝杆菌生长相关性的研究,Q78
  3. RNA干扰抑制ERCC1对非小细胞肺癌化疗敏感性的影响（体外实验）,R734.2
  4. 结核分枝杆菌WecA膜蛋白的表达和功能分析,R378
  5. MRSA对万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺体外诱导耐药性比较,R446.5
  6. 蛋白酶体抑制剂硼替佐米对K562细胞中MDR1表达的影响,R733.7
  7. Myotrophin在胃癌细胞株SGC7901和SGC7901/ADR中表达的差异性研究,R735.2
  8. 硅化合物SILA409对人小细胞肺癌GRP78表达及与VP-16耐药的研究,R734.2
  9. MRP1功能变化对人肺腺癌细胞化疗耐药的影响,R734.2
  10. 顺铂对小鼠肺癌细胞中P-糖蛋白表达的影响,R734.2
  11. 重组人血管内皮抑制素逆转人肺腺癌A549/DDP细胞耐药性的研究,R734.2
  12. 无血清培养联合顺铂富集人肺癌干细胞的体外基础研究,R734.2
  13. 结核分枝杆菌Rv3717基因的克隆、表达及功能鉴定,R378
  14. 结核分枝杆菌Rv1096的表达及功能鉴定,R378
  15. 应用抑制性差减杂交技术分离白血病多药耐药相关基因,R733.7
  16. 脑胶质瘤中耐药相关基因的表达及临床意义,R739.4
  17. 恩替卡韦耐药慢性乙型肝炎病毒全基因特征、质粒构建及其挽救治疗,R512.62
  18. 整合素β1表达上调对非小细胞肺癌EGFR TKI耐药的影响,R734.2
  19. 结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖的提纯及血清学诊断应用,R521
  20. 芳乙烯基咪唑类化合物的设计、合成及其抗耐药菌活性研究,R96
  21. RRM1、MDR1与宫颈鳞癌新辅助化疗敏感性的关系,R737.33

中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
© 2012 www.xueweilunwen.com