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结核分枝杆菌Rv3717基因的克隆、表达及功能鉴定

作　者: 陈燕
导　师: 辛毅
学　校: 大连医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 结核分枝杆菌乙胺丁醇肽聚糖水解酶 Rv3717
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

结核分枝杆菌是全球主要的病原体之一,随着多重耐药菌株的增加,其威胁性也随之增大。结核分枝杆菌的细胞壁相对较厚、硬并且具有疏水性,能够有效地保护细菌,因此抗菌药物的开发具有较高的难度。乙胺丁醇（Ethambutol,EMB）,是一种一线抗结核的药物。本课题利用生物信息学的方法,发现一种未知功能的基因Rv3717。当乙胺丁醇作用于结核分枝杆菌后,Rv3717基因的表达上调。该基因被预测具有水解肽聚糖的功能,可能会造成肽聚糖的水解,引起细胞的自溶。肽聚糖是结核分枝杆菌细胞壁核心结构的重要组成部分,目前关于分枝杆菌细胞壁自溶素（也称为肽聚糖水解酶）的了解并不多。已知枯草芽孢杆菌的cwlB基因是一种已知的细胞壁自溶素,把此基因的序列与结核分枝杆菌的基因组序列进行BLAST比对,找到两种同源基因Rv3915和Rv3717,推测该两种基因表达的蛋白质可能同样具有肽聚糖水解酶的活性。有研究表明,Rv3915基因被成功克隆表达并且经鉴定具有肽聚糖水解酶的活性。因此,Rv3717基因是否也有此活性是本课题所要解决的问题。对Rv3717基因肽聚糖水解酶活性的确定,有利于揭示EMB抗结核的作用机制,并为发现新的药物靶点进而开发新一代抗结核药物提供理论依据。目的:通过对Rv3717目的基因的克隆表达,纯化目的蛋白,以对Rv3717基因的功能进行鉴定。方法:以结核分枝杆菌基因组DNA为模板,利用PCR技术进行目的基因的扩增。使用克隆载体pMD18-T与目的基因以“A-T”连接方式构建克隆质粒pMD18-Rv3717;被扩增的目的片段经测序正确后,载体和目的片段分别经双酶切后进行连接,构建表达质粒。利用不同的载体和不同的宿主菌,通过调节诱导剂的浓度和诱导温度等进行目的蛋白的优化表达。利用SDS-PAGE和Western blotting检测目的基因的表达,利用Ni²⁺亲和层析柱对目的蛋白进行纯化并用酶谱法对目的蛋白进行功能的检测。结果:构建了克隆质粒pMD18-Rv3717;扩增的目的基因经测序正确后,构建了无突变碱基的表达质粒pET29b-Rv3717和pET16b-Rv3717。表达质粒pET29b-Rv3717在所使用的各种宿主菌中的蛋白表达量极低。表达质粒pET16b-Rv3717在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达量高,但是绝大部分是以包涵体的形式存在,上清液中的可溶性目的蛋白比较少。目的蛋白的上清液经镍柱纯化以后,得到含有少量杂蛋白的目的蛋白的纯化物。纯化的目的蛋白没有检测到肽聚糖水解酶的活性。结论:利用分子克隆技术克隆了结核分枝杆菌的基因Rv3717;使用表达质粒pET16b在大肠杆菌BL21（DE3）中过表达了目的基因,并且绝大部分目的蛋白是以包涵体的形式存在。本论文论述了目的基因Rv3717与肽聚糖水解酶的关系,未能检测出过表达的目的蛋白的肽聚糖水解酶的活性,但为进一步地探讨两者之间的关系提供了方法学的借鉴和物质基础。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-10
前言  10-11
材料  11-13
方法  13-24
结果  24-35
讨论  35-39
结论  39-40
参考文献  40-43
综述  43-52
  参考文献  49-52
致谢  52

结核分枝杆菌Rv3717基因的克隆、表达及功能鉴定

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