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SAAT法介导铁皮石斛遗传转化及NAC启动子的克隆与载体构建

作　者: 尤超
导　师: 王万军
学　校: 西南交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: SAAT NAC转录因子启动子
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

NSC转录因子是植物特有的、家族成员较多的一类转录因子,其表达受植物发育时期和多种环境因素的诱导,并在植物发育、激素反应以及抗逆性的调控中起重要作用。本实验以铁皮石斛愈伤组织诱导的类原球茎为实验材料,优化超声波处理辅助农杆菌介导铁皮石斛遗传转化体系,使用常规PCR法分离克隆NAC转录因子,再采用染色体步移法获得NAC转录因子5’和3’侧翼序列,通过生物信息学手段对启动子和基因结构进行预测,并构建该启动子的表达载体,从而为进一步研究NAC启动子遗传转化和调控机制提供思路和手段,主要研究结果如下：(1)以铁皮石斛愈伤组织诱导的类原球茎为材料,通过PLBs对潮霉素敏感性实验确定潮霉素选择压,结果发现,PLBs对潮霉素较为敏感,10mg/L潮霉素能够有效抑制PLBs的增殖和分化并完全死亡,因此确定10mg/L为潮霉素有效选择压浓度。(2)优化SAAT法转化条件,研究超声波预处理时间、根瘤农杆菌侵染时间和共培养时间对GUS瞬时表达率的影响,实验结果表明,使用40KHZ、90W的超声波对预培养2d的PLBs超声处理3min,再用预培养2hr的OD600为0.8-0.95的农杆菌侵染液侵染30min,转入共培养基暗培养5d,所获得的蓝色斑点数为42个/100mg PLBs,而且其除菌也相对容易,其中预培养基、侵染液和共培养基中均含有100μM AS。(3)采用常规PCR法和染色体步移法分离克隆出一条长度为6324bp的基因序列,通过分析发现,NAC转录因子在起始密码子和终止密码子之间长度为1611bp,含有3个外显子和2个内含子,在距离终止密码子下游859处和886处分别有一个ployA结构和Stem-loop结构,在TTS上游348处和378处分别为TSS位点和TATA box。5’侧翼序列长度为TSS前3401bp, PlantCare分析表明,该序列不仅含有TATA box、CAAT box等启动子核心顺式作用元件,而且含有光信号反应元件、激发子响应元件、生理节律元件、激素诱导相关的顺式作用元件、生长发育相关顺式元件和逆境肋、迫响应元件,这些顺式元件的存在与NAC转录因子主要生物学功能相符合。(4)通过软件预测,确定翻译起始位点上游862bp大小的序列为NAC启动子核心区域,分离克隆该段基因,并构建表达载体,采用冻融法转入到农杆菌中,经双酶切验证证明构建和转化成功。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-12
第一章绪论  12-21
  1.1 兰科植物遗传转化研究进展  12-14
    1.1.1 PEG法  12
    1.1.2 电激法  12-13
    1.1.3 花粉管通道法  13
    1.1.4 基因枪法  13
    1.1.5 农杆菌介导法  13-14
  1.2 影响农杆菌介导兰科植物遗传转化的因素  14-16
    1.2.1 农杆菌菌株类型  14-15
    1.2.2 菌液浓度  15
    1.2.3 酚类化合物  15-16
    1.2.4 外植体的类型和处理方式  16
    1.2.5 预培养时间  16
    1.2.6 共培养时间  16
  1.3 超声波辅助农杆菌介导法的研究进展  16-18
  1.4 NAC基因研究进展  18-20
  1.5 本实验研究意义  20-21
第二章超声波处理辅助根瘤农杆菌介导铁皮石斛遗传转化体系的初步建立  21-31
  2.1 材料  21-23
    2.1.1 植物材料  21
    2.1.2 实验试剂  21
    2.1.3 培养基  21-22
    2.1.4 根瘤农杆菌菌株类型及质粒载体  22-23
  2.2 方法  23-24
    2.2.1 转化感受体的制备  23
    2.2.2 PLBs对潮霉素敏感性实验  23
    2.2.3 农杆菌的活化及侵染液的制备  23
    2.2.4 超声波预处理、侵染和共培养  23
    2.2.5 GUS组织化学检测  23-24
    2.2.6 转化后PLBs的筛选  24
  2.3 结果与分析  24-28
    2.3.1 不同浓度潮霉素对PLBs生长的影响  24-26
    2.3.2 不同超声时间对GUS瞬时表达率的影响  26-27
    2.3.3 不同侵染和共培养时间对GUS瞬时表达率的影响  27-28
  2.4 讨论  28-31
    2.4.1 超声波处理对遗传转化的影响  28-29
    2.4.2 PLBs生理状态、预培养时间和乙酰丁香酮浓度的选择  29-30
    2.4.3 不同侵染和共培养时间对遗传转化的影响  30
    2.4.3 后续工作  30-31
第三章铁皮石斛兰NAC基因的分离与克隆  31-40
  3.1 材料与方法  31-36
    3.1.1 材料  31-32
    3.1.2 方法  32-36
  3.2 结果与分析  36-40
    3.2.1 铁皮石斛基因组DNA的提取  36
    3.2.2 NAC基因PCR反应  36-37
    3.2.3 NAC基因组DNA片段的回收  37
    3.2.4 重组质粒的鉴定  37-38
    3.2.5 测序结果分析  38-40
第四章 NAC基因启动子的克隆与表达载体的构建  40-59
  4.1 材料与方法  40-48
    4.1.1 材料  40-41
    4.1.2 方法  41-48
  4.2 结果与分析  48-57
    4.2.1 5’和3’方向染色体步移结果  48-50
    4.2.2 5’未知序列的重组质粒和3’未知序列的重组质粒的双酶切验证  50-51
    4.2.3 5’和3’侧翼序列的分析结果  51-56
    4.2.4 NAC启动子的克隆及表达载体的鉴定  56-57
  4.3 讨论  57-59
参考文献  59-65
致谢  65-66
攻读硕士学位期间发表的学术论文及科研成果  66-67
附录  67-69

SAAT法介导铁皮石斛遗传转化及NAC启动子的克隆与载体构建

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