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灵芝真菌免疫调节蛋白基因在虫草真菌中的表达与特性分析

作　者: 帖卫芳
导　师: 祝建波；林忠平
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 冬虫夏草灵芝免疫调节蛋白 GPD启动子 KDEL
分类号: S567.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

冬虫夏草(Cordyceps.)在分类上属于子囊菌纲肉座菌目麦角菌科虫草属真菌,是我国古已有之的药用真菌。虫草生长于高山雪原,冬天为虫夏天为草,数量稀少且难于采摘,历来在我国与人参、鹿茸并称为三大补品,其药用价值非常广泛,在保肺益肾、抗癌方面尤为突出。近年来,随着虫草各方面药效的不断开发和利用,虫草的研究也备受人们的关注,但对于其实验室培养以及在分子生物学方面的研究却相当鲜见。所以对虫草进行分离鉴定、纯化培养、分子学修饰,研究并提高其免疫调节功能的药用价值有非常重要的现实意义和经济价值。真菌免疫调节蛋白(Fungal immunomodulatory protein, Fip)是近几年来新发现的一个蛋白质家族,其结构和功能与免疫球蛋白及植物凝集素相似。1989年,Kino等从灵芝(Ganoderma lucidum)中分离纯化到第一种真菌免疫调节蛋白LZ-8。随后,其他免疫调节蛋白也被分离得到。该类蛋白可以促进人类末梢淋巴球(human peripheral lymphocytes)细胞以及白鼠脾淋巴细胞的增生等,增强人体免疫机能。将灵芝真菌的免疫调节蛋白基因转入冬虫夏草菌中发挥其强大的医疗保健效果,不仅为虫草的分子生物学研究开辟了道路,而且可以带来非常可观的经济效益。本研究从采白新疆的冬虫夏草虫体中分离得到冬虫夏草菌丝,对其进行分子生物学和形态学等多方面研究,鉴定其品种并确定纯化到的菌丝为冬虫夏草(Cordyceps scarabaeicola)。且进一步对虫草的培养条件进行优化,获得较纯的生长旺盛的菌丝体。用RT-PCR的方法成功从灵芝(Ganoderma lucidum)菌丝体中扩增得到真菌免疫调节蛋白(Fip)基因,对其进行修饰,加内质网滞留信号(ER retention signal) KDEL序列,以提高外源蛋白的表达量。在实验室真菌转化相关经验的基础上,选用克隆自香菇的真菌强启动子GPD(三磷酸甘油醛脱氢酶)驱动免疫调节蛋白(Fip)基因,以具有除草剂(PPT)抗性的bar基因作为筛选标记基因,构建真菌表达载体p3300bfipk。然后通过农杆菌介导的方法将构建好的表达载体导入至冬虫夏草(Cordyceps scarabaeicola)基因组中,通过筛选获得抗性菌株。对抗性菌株进行PCR检测,得到转基因虫草。挑选生长情况良好的转基因虫草菌株,提取RNA进行RT-PCR分析,结果发现部分阳性菌株中的目的基因均在转录水平可以检测到。本研究不仅对虫草进行了分子生物学方面的研究,且为虫草免疫调节方面药理功能的更深入研究奠定了一定的理论基础,为进一步将转基因虫草等名贵药材应用于实际生产提供了新的实验依据。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-9
英文缩写词表  9-10
引言  10-11
第一部分文献综述  11-20
  1 冬虫夏草  11-13
    1.1 虫草的形态特征  11
    1.2 虫草的研究现状  11-12
    1.3 虫草的应用前景  12-13
  2 启动子的选择及辅助元件的应用  13-15
    2.1 启动子的选择  13
    2.2 辅助元件的应用  13-15
  3 真菌免疫调节蛋白的研究现状  15-20
    3.1 免疫调节蛋白的发现及其特征  15-19
    3.2 免疫调节蛋白的前景及展望  19-20
第二部分研究内容  20-47
  实验一冬虫夏草菌丝的分离及培养  20-31
    1 实验材料  20-21
      1.1 真菌材料  20
      1.2 培养基  20
      1.3 分子生物学与生物化学试剂  20
      1.4 主要仪器设备  20-21
      1.5 引物  21
    2 实验方法  21-24
      2.1 虫草真菌的分离及纯化  21
      2.2 虫草真菌菌丝染色  21
      2.3 虫草真菌基因组DNA的提取  21-22
      2.4 虫草真菌的18S rDNA的扩增  22
      2.5 DNA片段的回收连接与测序  22-23
      2.6 虫草真菌培养基条件的优化  23-24
    3 实验结果  24-29
      3.1 虫草真菌的分离及纯化  24
      3.2 虫草真菌的染色分析  24-25
      3.3 虫草真菌基因组18S rDNA的扩增  25
      3.4 虫草真菌测序结果分析  25-28
      3.5 虫草培养基条件的优化  28-29
    4 讨论  29-30
    5 小结  30-31
  实验二灵芝真菌免疫调节蛋白基因在虫草中的表达  31-47
    1 实验材料  31-32
      1.1 真菌材料  31
      1.2 菌种和质粒  31
      1.3 培养基  31
      1.4 分子生物学与生物化学试剂  31
      1.5 引物  31-32
    2 实验方法  32-38
      2.1 灵芝总RNA的提取  32
      2.2 真菌免疫调节蛋白基因的克隆  32-33
      2.3 PCR得到的fip基因的回收连接与测序  33
      2.4 对克隆到的fip基因进行修饰  33
      2.5 PCR得到的fipk基因的回收连接与测序  33
      2.6 p3300bfipk载体的构建  33-35
      2.7 表达载体正确性的鉴定  35
      2.8 表达载体转化农杆菌  35-36
      2.9 根癌农杆菌介导法转化虫草菌丝  36
      2.10 转基因虫草真菌的鉴定  36-38
    3 实验结果  38-45
      3.1 灵芝中fip基因的克隆  38
      3.2 fip基因的修饰  38-39
      3.3 p3300bfipk载体的构建  39-41
      3.4 表达载体正确性的鉴定  41-42
      3.5 根癌农杆菌介导法转化虫草菌丝  42-43
      3.6 转基因虫草真菌的鉴定  43-45
    4 讨论  45-46
    5 小结  46-47
参考文献  47-52
致谢  52-53
作者简介  53-54
导师评阅表  54

灵芝真菌免疫调节蛋白基因在虫草真菌中的表达与特性分析

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