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甘蓝夜蛾中两种不同类型几丁质脱乙酰基酶基因的克隆与表达研究

作　者: 姚磊
导　师: 樊东
学　校: 东北农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 甘蓝夜蛾几丁质脱乙酰基酶克隆表达
分类号: S433.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

昆虫蜕皮是一个复杂的生理过程,在这个过程中有多种酶、激素和受体分子参与其中。本研究对在其中分解几丁质起到重要作用的几丁质脱乙酰基酶基因进行了初步研究。通过破坏昆虫几丁质脱乙酰基酶合成或降解途径将对昆虫非常有害,在实际应用中使其成为害虫生物防治的又一靶标。几丁质(chitin)又称甲壳素、甲壳质等,是由N-乙酰-D-葡萄糖胺通过β-1,4糖苷键连接而成的直链高分子化合物。在自然界中,几丁质存在于真菌及藻类的细胞壁、无脊椎动物的外骨骼及表皮中,是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生自然资源。研究证明,几丁质是昆虫表皮和围食膜的重要组成成分,昆虫生长、发育的各个时期都需要一定量的几丁质。几丁质脱乙酰基酶(chitin deacetylase,简称CDA,EC.3.5.1.41)。CDA来源广泛,如真菌、酵母和昆虫中都发现CDA的存在,是几丁质降解酶系成员之一,能够催化几丁质中β-1,4糖苷键连接的N-乙酰基葡糖胺的乙酰胺基的水解,可以将几丁质转化为壳聚糖,在是昆虫几丁质代谢中一种关键酶,在昆虫的多种生理活动中发挥重要作用。本研究以甘蓝夜蛾Mamestra brassicae 5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,分别扩增得到甘蓝夜蛾的2种不同几丁质脱乙酰基酶基因的cDNA序列。其中一种CDA含有2036个碱基,包括一个1617个碱基的开放读码框,编码一个含539个氨基酸的蛋白,分子量约为61.5KDa,我们定义其为cDNA 1;另一种CDA含有1312个碱基,包括一个1173个碱基的开放阅读框,编码一个含390个氨基酸的蛋白,分子量约为44.1 KDa,我们定义其为cDNA 2。cDNA 1推导的氨基酸序列具有几丁质脱乙酰基酶典型的三个功能区,分别是几丁质结合区,催化区和低密度脂蛋白受体区,属于CDA第1组(group I)的成员。cDNA 2推导的氨基酸序列只有几丁质催化区,属于CDA第5组(group V)的成员。利用RT-PCR进行该基因在mRNA水平上的表达表明几丁质脱乙酰基酶cDNA 1在幼虫取食期的唾腺、中肠、脂肪体组织表达,在体壁和马氏管中不表达;cDNA 2只在幼虫期的中肠表达,在其他组织及时期都不表达。将cDNA 1基因利用表达载体pET21b进行原核表达,经异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得分子量约61.5KDa的蛋白。获得的基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号,cDNA 1登录号为HQ680620,cDNA 2登录号为HQ680621。

全文目录

中文摘要  10-11
英文摘要  11-12
1 引言  12-17
  1.1 几丁质简介  12-13
  1.2 昆虫几丁质脱乙酰基酶  13-15
    1.2.1 昆虫几丁质及几丁质脱乙酰基酶简介  13
    1.2.2 昆虫几丁质脱乙酰基酶的结构  13-14
    1.2.3 昆虫脱乙酰基酶的生物学作用  14
    1.2.4 昆虫脱乙酰基酶在昆虫生物防治中的作用  14-15
  1.3 几丁质脱乙酰基酶的最早研究报道  15
  1.4 甘蓝夜蛾简介  15-16
  1.5 本论文研究的目的和意义  16
    1.5.1 研究目的  16
    1.5.2 研究意义  16
  1.6 本研究课题的来源及主要研究内容  16-17
2 材料与方法  17-34
  2.1 材料  17-18
    2.1.1 菌株与质粒  17
    2.1.2 分子生物学用酶及试剂盒和各种试剂  17
    2.1.3 培养基  17-18
    2.1.4 仪器设备  18
    2.1.5 昆虫来源  18
  2.2 研究方法  18-27
    2.2.1 昆虫总RNA 的提取  18-20
    2.2.2 第一链cDNA 的合成  20
    2.2.3 利用RT‐PCR 技术克隆基因cDNA 序列片段  20-23
    2.2.4 3’的试验步骤  23
    2.2.5 5’‐RACE 的试验步骤  23-27
    2.2.6 全长cDNA 的获取及其序列分析  27
  2.3 序列分析  27-28
    2.3.1 利用Blast 软件进行序列相似性检索  27
    2.3.2 分子质量、碱基组成、碱基分布  27
    2.3.3 全长cDNA 可读框架分析  27-28
    2.3.4 对ORF 进行限制性酶切分析  28
    2.3.5 核酸序列对齐分析的功能预测  28
  2.4 蛋白质基本性质分析  28-29
  2.5 蛋白质功能预测  29
    2.5.1 蛋白质序列同源性分析及蛋白质功能预测  29
    2.5.2 结构位点、结构功能域数据库的蛋白质功能预测  29
  2.6 蛋白质结构预测  29-30
    2.6.1 蛋白质二级结构预测  29
    2.6.2 蛋白质三级结构预测  29-30
  2.7 CDA 基因的时空表达研究  30
  2.8 CDA CDNA 1 基因在大肠杆菌中的表达研究  30-34
    2.8.1 CDA cDNA 1 基因cDNA 序列ORF 的PCR 反应  30-31
    2.8.2 PCR 产物酶切反应  31
    2.8.3 E coli 质粒DNA 提取和酶切  31
    2.8.4 大肠杆菌表达载体构建  31-33
    2.8.5 几丁质脱乙酰基酶cDNA 1 基因在大肠杆菌中诱导表达  33
    2.8.6 SDS‐PAGE 电泳  33-34
3 结果与分析  34-53
  3.1 RT‐PCR 得到的基因特异性片段及序列分析  34-35
    3.1.1 CDA cDNA 1 基因特异性片段及序列分析  34-35
    3.1.2 CDA cDNA 2 基因特异性片段及序列分析  35
  3.2 CDNA 序列的3’结果  35-36
    3.2.1 CDA cDNA 1 基因cDNA 序列的3’结果  35-36
    3.2.2 CDA cDNA 2 基因cDNA 序列的3’结果  36
  3.3 CDNA 序列的5’‐RACE 结果  36-37
    3.3.1 CDA cDNA 1 基因5’‐RACE 结果  36-37
    3.3.2 CDA cDNA 2 基因5’‐RACE 结果  37
  3.4 CDA CDNA 序列的获得  37-40
    3.4.1 CDA cDNA 1 基因序列的获得  37-39
    3.4.2 CDA cDNA 2 基因序列的获得  39-40
  3.5 CDA CDNA 的基因特征  40-43
    3.5.1 碱基序列组成分析  40-41
    3.5.2 氨基酸序列组成分析  41-42
    3.5.3 信号肽分析  42-43
  3.6 氨基酸结构域预测  43-45
    3.6.1 CDA cDNA 1 氨基酸结构域预测  43-44
    3.6.2 CDA cDNA 2 氨基酸结构域预测  44-45
  3.7 氨基酸的疏水性分析  45-46
    3.7.1 CDA cDNA 1 氨基酸疏水性分析  45
    3.7.2 CDA cDNA 2 氨基酸疏水性分析  45-46
  3.8 昆虫几丁质脱乙酰基酶氨基酸序列同源性和系统进化分析  46-50
  3.9 CDA 时空表达结果  50-51
  3.10 甘蓝夜蛾CDA CDNA 1 基因在大肠杆菌中的表达  51-53
    3.10.1 大肠杆菌重组表达载体的构建和鉴定  51
    3.10.2 CDA cDNA 1 基因在大肠杆菌中的融合表达  51-53
4 讨论  53-54
5 结论  54-55
致谢  55-56
参考文献  56-59
攻读硕士学位期间发表的学术论文  59

甘蓝夜蛾中两种不同类型几丁质脱乙酰基酶基因的克隆与表达研究

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