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干扰黄瓜花叶病毒（CMV）人工MicroRNAs的构建及其遗传转化

作　者: 沈宝明
导　师: 谭周进；刘勇
学　校: 湖南农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 黄瓜花叶病毒 2b基因 人工microRNA 转录后基因沉默 转基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus, CMV)是一种世界性病害,寄主范围广、能够被蚜虫传播、防治十分困难。尽管防治CMV的方法有多种,其中药剂防治会增加成本并带来环境污染；疫苗因环境变化而表现不稳定：自然抗病育种周期长且效率低；因而利用基因工程进行种质资源创新成为控制CMV的重要手段。特别是双链RNAs介导的基因沉默为改良作物对CMV的抗性发挥重要作用,但仅仅对供体CMV株系具有抗性,且低温时抗性容易突破,限制了生产应用。而miRNAs介导的基因沉默不仅诱导目标病毒的抗性,且保持低温时抗性稳定性,并将目标片段最小化和降低病毒异源重组风险。本研究利用miRNAs基因沉默技术,以抗性突破株系CMV-AN的2b基因高度保守区域为靶标,以植物起源的miRNA319前体为骨架,进行人工miRNA319的构建,以期望诱导CMV的广谱抗性。本研究结果如下：1.利用抗性突变株系CMV-AN 2b基因的30bp保守序列为靶标,以植物miR319前体为骨架,通过引物融合技术和OverlapPCR技术,用靶序列替换miR319前体miRNA:miRNA*区的突出部分,成功获得了amiR319。2.在限制性酶切位点BamHI和HindⅢ处将amiR319导入含双T7启动子的原核载体pLITMUS28i,获得重组载体pLITMUS28i-amiR319,以pLITMUS28i-miR319作对照,导入大肠杆菌HT115(RNaseⅢ缺失)菌株中供研究离体条件下amiR319介导CMV的抗性。3.利用限制性酶切位点BamHI和NcoⅠ将amiR319与中间载体替换获得2×35S:amiR319:poly(A)片段,并将其导入植物双元表达载体pCAMBIA1300,获得重组载体PCAMBIA1300-amiR319,以pCAMBIA1300-miR319作对照,分别导入农杆菌LB4404,通过酶切验证2x35S：amiR319:poly(A)片段及对照片段均为正向插入。4.利用农杆菌介导的叶盘转化法,将重组载体pCAMBIA1300-amiR319、pCAMBIA1300-miR319转入到三生烟中,转基因烟草对CMV的抗性有待于进一步研究。

全文目录


摘要  4-5
Abstracts  5-9
第一章 文献综述  9-21
  1 黄瓜花叶病毒概述  9-10
    1.1 黄瓜花叶病毒的分类地位、病原形态及生物学  9
    1.2 黄瓜花叶病毒的分布及危害症状  9-10
    1.3 黄瓜花叶病毒的发生规律及传毒介体  10
  2 黄瓜花叶病毒的防治  10-13
  3 转录后基因沉默  13-19
    3.1 转录后基因沉默的发现及定义  13
    3.2 转录后基因沉默的分类和相关作用机制  13-15
    3.3 RNA沉默的病毒抑制子  15-17
    3.4 人工microRNA抗病研究进展  17-19
  4 本研究的背景及技术路线  19-21
    4.1 研究背景  19
    4.2 技术路线  19-21
第二章 人工microRNA319的构建  21-33
  1 材料  21-22
    1.1 供试菌株和载体  21
    1.2 供试试剂  21
    1.3 引物  21-22
    1.4 常用试剂的配制  22
  2 方法  22-30
    2.1 DNA分子操作常规技术  22-29
    2.2 人工microRNA319的构建示意图  29-30
  3 结果与分析  30-32
    3.1 人工microRNA319的构建  30-32
    3.2 人工microRNA319测序结果  32
    3.3 人工microRNA319电泳检测  32
  4 讨论  32-33
第三章 amiRNA319原核表达载体的构建  33-40
  1 材料  33
    1.1 供试菌株和载体  33
    1.2 供试试剂  33
    1.3 引物  33
    1.4 常用试剂的配制  33
  2 方法  33-36
    2.1 DNA分子操作常规技术  33-35
    2.2 amiR319原核表达载体的构建策略  35
    2.3 miR319原核表达载体的构建策略  35-36
    2.4 原核表达载体转大肠杆菌HT115(RNaseⅢ缺失)  36
  3 结果与分析  36-39
    3.1 amiR319原核表达载体构建过程  36-37
    3.2 miR319原核表达载体构建过程  37-38
    3.3 原核表达载体转大肠杆菌HT115(RNaseⅢ缺失)  38-39
  4 讨论  39-40
第四章 amiRNA319双元表达载体的构建  40-47
  1 材料  40
    1.1 供试菌株和载体  40
    1.2 供试试剂  40
    1.3 引物  40
    1.4 常用试剂的配制  40
  2 方法  40-43
    2.1 DNA分子操作常规技术  40-42
    2.2 amiRNA319双元表达载体的构建策略  42
    2.3 miRNA319双元表达载体的构建策略  42-43
    2.4 双元表达载体转化农杆菌LB4404  43
  3 结果与分析  43-46
    3.1 amiRNA319双元表达载体构建过程图  43-44
    3.2 miRNA319双元表达载体构建过程图  44-46
    3.3 双元表达载体转化农杆菌LB4404  46
  4 讨论  46-47
第五章 双元表达载体在烟草中表达  47-51
  1 材料  47
    1.1 供试菌株和载体  47
    1.2 植物材料  47
    1.3 供试试剂  47
    1.4 植物培养基  47
  2 方法  47-49
    2.1 用于转化的根癌农杆菌的准备  48
    2.2 烟草遗传转化体系的建立  48-49
  3 结果与分析  49-50
    3.1 潮霉素临界值的筛选结果  49
    3.2 转基因烟草再生苗的获得  49-50
  4 讨论  50-51
第六章 结论和创新点  51-52
  1 结论  51
  2 创新点  51-52
参考文献  52-61
附录A 本论文所用重要缩写词及中文对照  61-62
附录B 常用缓冲液及培养基配方  62-65
附录C 常用的抗生素配制方法及使用浓度  65-66
附录D 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器  66-67
附录E amiRNA319序列测序比对结果  67-68
致谢  68-69
个人简历  69

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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