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转基因Roundup Ready大豆外源CP4-EPSPS蛋白及内外源基因在食品加工过程中的降解变化规律

作　者: 吴洪洪
导　师: 沈文飚
学　校: 南京农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 转基因Roundup Ready大豆 加工过程 CP4-EPSPS蛋白及基因降解 外源模拟实验
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


转基因抗农达(Roundup Ready)大豆是由美国孟山都公司开发生产的一种转基因大豆新品种,它将来源于土壤农杆菌CP4菌株的EPSPS合酶编码基因转入到大豆中并使之正确表达,从而获得了比野生型大豆品种对农药草甘膦更高的抗性。相较于常规大豆品种而言,在实际的农业生产种植中,对农药草甘膦具有高抗性的转基因抗农达大豆(RR大豆)更易于管理,也减小了生产成本,从而得到迅速的推广种植。在转基因食品的安全性问题越来越受到人们关注的背景下,作为主要的大规模推广种植的转基因作物品种之一的转基因RR大豆成为了转基因食品安全领域的主要研究对象之一。但目前国内外的研究主要集中在转基因RR大豆检测新技术新手段这一方面,而对转基因RR大豆在食品加工生产过程中的研究则比较鲜见。转基因大豆加工生产过程中,不仅有物理化学的变化,同时也有生物学因素的参与,这无疑给相应的研究增加了一定的难度。本文以转基因RR大豆在加工生产过程中因物理、化学、生物学因素等原因导致其内外源基因发生了降解的情况为着眼点,应用PCR技术和Western blot技术来研究加工生产过程中转基因RR大豆内外源基因及外源CP4-EPSPS蛋白是否发生降解以及可能的降解规律,并辅助以外源模拟实验来验证可能的降解规律。本研究发现,随着加工的进行,转基因RR大豆在加工过程中内外源基因及外源CP4-EPSPS蛋白都发生了一定程度的降解；而且随着加工程度的加深,外源CP4-EPSPS蛋白及基因均表现出更深程度的破坏或降解。且外源模拟条件下,转基因RR大豆在不同的模拟加工条件(高温处理、微波、高温高压等)下其外源CP4-EPSPS蛋白及基因也均出现降解情况。通过Western blot技术手段,本研究进一步发现在转基因RR大豆加工成常规食品的过程中外源CP4-EPSPS蛋白219-233 aa区段的DADGVRTIRLEGRGK多肽片段对加工因素的稳定性要高于19-33 aa区段的SGTVRIPGDKSISHR多肽片段,表现为19-33 aa区段的SGTVRIPGDKSISHR多肽片段在本研究涉及的加工因素的处理下先发生断裂或降解；且外源Cp4-epsps基因843-1123 bp区段在本研究涉及的加工条件下较为稳定,内源lectin基因1144-1305 bp区段在本研究涉及的加工条件下较为稳定。外源模拟大豆加工过程中加工条件的实验也得到了类似的结果。本文中进一步的研究则发现,外源使用生物制品如水解酶(木瓜蛋白酶(8000 U／g底物)、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰酶及核糖核酸酶)来处理转基因RR大豆粉时,其外源CP4-EPSPS蛋白和基因也都发生了降解。木瓜蛋白酶处理及胃蛋白酶处理条件下,转基因Roundup Ready大豆中外源CP4-EPSPS蛋白19-33位SGTVRIPGDKSISHR多肽片段与219-233位DADGVRTIRLEGRGK多肽片段均不稳定(胰蛋白酶处理及核糖核酸酶A处理结果与之相反)；而胰酶处理下,CP4-EPSPS蛋白219-233位DADGVRTIRLEGRGK多肽片段则比19-33位SGTVRIPGDKSISHR多肽片段表现稳定。此外,水解酶处理条件下,转基因RR大豆内外源基因也发生了降解,推测可能是水解酶处理导致包裹核酸的一些蛋白发生了降解从而导致核酸某些区段被暴露出来并在内源存在的核酸酶及一些其他因素的共同作用下发生了降解。该研究结果进一步说明在生产加工过程中,水解酶在转基因RR大豆外源CP4-EPSPS蛋白及基因的降解过程中起到了一定的作用。总之,上述的研究结果表明转基因RR大豆加工生产过程中外源CP4-EPSPS蛋白及基因的降解是一个比较复杂的过程,不仅涉及到各种物理化学变化,也涉及到了加工过程中的生物学变化,而且其降解过程具有一定的规律性。本研究不仅充实了转基因食品制品的基础理论研究,同时也为市场上转基因食品的安全检测提供了更为可靠的科学依据和有效的技术手段。

全文目录


摘要  8-10ABSTRACT  10-12缩略语词汇表  12-13第一章 文献综述  13-19  1 转基因大豆生产现状  13-15  2 转基因产品检测技术  15-16  3 转基因作物外源蛋白及基因的研究现状  16-18  4 本研究的目的和内容  18-19第二章 Cp4-epsps基因的原核表达及纯化  19-33  引言  19  1 材料、试剂与仪器  19-20    1.1 实验材料  19    1.2 菌株和质粒载体  19    1.3 主要试剂  19-20    1.4 仪器及设备  20  2 实验方法  20-27    2.1 引物设计  20-21    2.2 抗体合成  21-22    2.3 样品蛋白质提取  22    2.4 样品总DNA提取  22    2.5 PCR扩增  22-23    2.6 DNA片段的凝胶回收  23-24    2.7 重组子的构建  24    2.8 重组子转化大肠杆菌感受态  24    2.9 大肠杆菌中质粒DNA的小量提取—碱裂解法  24-25    2.10 重组子的筛选和鉴定  25    2.11 测序及比对  25    2.12 外源基因全长克隆及原核表达,纯化  25-26    2.13 Western blot分析  26-27  3 结果与分析  27-31    3.1 转基因RR大豆粉中Cp4-epsps基因的克隆与原核表达  27-29      3.1.1 转基因RR大豆粉中DNA提取及Cp4-epsps基因PCR扩增  27      3.1.2 pMD 19T-Cp4-epsps克隆载体的构建、筛选与酶切验证  27-28      3.1.3 pET 32a-Cp4-epsps原核表达载体的构建、筛选与酶切验证  28-29      3.1.4 Cp4-epsps基因的诱导表达  29    3.2 CP4-EPSPS蛋白多克隆抗体的特异性验证  29-31  4 小结  31-33第三章 转基因Roundup Ready大豆加工过程中外源CP4-EPSPS蛋白及基因的降解变化规律  33-45  引言  33  1 材料、试剂与仪器  33-34    1.1 实验材料  33    1.2 主要试剂  33-34    1.3 仪器及设备  34  2 实验方法  34-39    2.1 商品化大豆食品制品中内外源基因的检测  34    2.2 转基因RR大豆制备成食品的加工过程中分步取样  34    2.3 样品蛋白质提取  34    2.4 样品DNA提取  34    2.5 PCR扩增  34-38      2.5.1 PCR扩增反应所用引物  34-37      2.5.2 PCR扩增反应程序  37-38    2.6 测序及比对  38    2.7 Western blot分析  38-39  3 结果与分析  39-44    3.1 商品化大豆产品中内源lectin基因的降解变化  39    3.2 商品化大豆产品中外源Cp4-epsps基因的检测及其降解变化  39-41    3.3 转基因RR大豆加工过程中外源CP4-EPSPS蛋白的降解变化  41-42    3.4 转基因RR大豆加工过程中Cp4-epsps基因的降解变化  42-44  4 小结  44-45第四章 加工条件处理下转基因Roundup Ready大豆外源CP4-EPSPS蛋白及基因的降解变化规律  45-59  引言  45  1 材料、试剂与仪器  45-46    1.1 实验材料  45    1.2 主要试剂  45-46    1.3 仪器及设备  46  2 实验方法  46-47    2.1 不同加工因素对转基因RR大豆粉的处理  46      2.1.1 高温处理  46      2.1.2 微波处理  46      2.1.3 高温高压处理  46    2.2 样品蛋白质提取  46    2.3 样品DNA提取  46    2.4 PCR扩增  46-47    2.5 测序及比对  47    2.6 Western blot分析  47  3 结果与分析  47-57    3.1 高温处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白及基因的降解变化规律的影响  47-50      3.1.1 高温处理下转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白的降解变化  48-49      3.1.2 高温处理下转基因RR大豆粉中基因的降解变化  49-50    3.2 微波处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白及基因的降解变化规律的影响  50-53      3.2.1 微波处理下转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白的降解变化  50-51      3.2.2 微波处理下转基因RR大豆粉中基因的降解变化  51-53    3.3 高温高压处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白及基因的降解变化规律的影响  53-57      3.3.1 高温高压处理下转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白的降解变化  53-55      3.3.2 高温高压处理下RR大豆粉中基因的降解变化  55-57  4 小结  57-59第五章 水解酶处理下转基因Roundup Ready大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白及基因的降解变化规律  59-79  引言  59  1 材料、试剂与仪器  59-60    1.1 实验材料  59    1.2 主要试剂  59-60    1.3 仪器及设备  60  2 实验方法  60-63    2.1 不同酶对转基因RR大豆粉的处理  60-61      2.1.1 木瓜蛋白酶处理  60      2.1.2 胃蛋白酶处理  60      2.1.3 胰蛋白酶处理  60-61      2.1.4 胰酶处理  61      2.1.5 RNase A处理  61    2.2 样品蛋白质提取  61    2.3 样品DNA提取  61-62    2.4 PCR扩增  62    2.5 测序及比对  62    2.6 Western blot分析  62-63  3 结果与分析  63-77    3.1 木瓜蛋白酶处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白及基因的影响  63-67      3.1.1 木瓜蛋白酶处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白的影响  63-65      3.1.2 木瓜蛋白酶处理对转基因RR大豆粉中基因的影响  65-67    3.2 胃蛋白酶处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白及基因的影响  67-70      3.2.1 胃蛋白酶处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白的影响  68      3.2.2 胃蛋白酶处理对转基因RR大豆粉中基因的影响  68-70    3.3 胰蛋白酶处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白及基因的影响  70-72      3.3.1 胰蛋白酶处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白的影响  70-71      3.3.2 胰蛋白酶处理对转基因RR大豆粉中基因的影响  71-72    3.4 胰酶处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白及基因的影响  72-74      3.4.1 胰酶处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白的影响  72-74      3.4.2 胰酶处理对转基因RR大豆粉中基因的影响  74    3.5 核糖核酸酶A处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白及基因的影响  74-77      3.5.1 核糖核酸酶A处理对转基因RR大豆粉中外源CP4-EPSPS蛋白的影响  75      3.5.2 核糖核酸酶A处理对转基因RR大豆粉中基因的影响  75-77  4 小结  77-79全文小结  79-81讨论  81-87参考文献  87-91研究生期间发表的论文  91-93致谢  93

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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