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dsRNA介导的烟草抗黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)研究

作 者: 宋培培
导 师: 江彤
学 校: 安徽农业大学
专 业: 植物病理学
关键词: CMV 2b基因 PVY HC-Pro基因 反向重复表达载体 基因沉默 抗病毒 转基因烟草
分类号: S432.41
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要


RNA沉默是植物体内固有的一种抗病毒防卫反应,而大多数植物病毒编码的RNA沉默抑制子可以克服这种寄主的防卫反应。本研究利用转录后基因沉默原理,分别构建含沉默抑制子CMV 2b基因、PVY HC-Pro基因部分片断以及融合2b和HC-Pro基因部分片段反向重复的植物表达载体,通过在植物体内形成dsRNA沉默目标基因2b和HC-Pro,获得了单独抗CMV、单独抗PVY以及双抗CMV和PVY的云烟85转基因烟草植株,明确了dsRNA介导的转基因抗病毒基因工程策略的可行性。1. CMV 2b基因的克隆和序列分析从安徽亳州采集表现明显CMV症状的烟草样本, RT-PCR扩增CMV RNA2部分片段,克隆并测序。其中包含的2b基因全长336个核苷酸,编码111个氨基酸。序列比对表明,来源于安徽烟草的CMV 2b基因与来源于韩国的2b基因AF033667的核苷酸序列相似性最高,达98.8 %。构建2b基因系统关系树,也表明来源于安徽烟草的CMV 2b基因与AF033667亲缘关系最近。2.反向重复植物表达载体的构建1)2b基因部分片断反向重复表达载体的构建以安徽CMV 2b为模板,分别扩增大小约为300 bp的正向片段2b (r)和反向片段2b (i)。先后将反向片段2b (i)和正向片段2b (r)分别插入载体pSK-In所含intron两侧,获得重组质粒pSK-2b (r)-In-2b (i)。再将含intron的正反向片段插入pBIN438,最终得到含2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b (r)-In-2b (i)。2)HC-Pro基因部分片段反向重复表达载体的构建(见陈伟论文)3)融合2b和HC-Pro基因部分片段反向重复表达载体的构建将HC-Pro基因部分序列反向重复片段插入质粒pBIN-2b (r)-In-2b (i),最终获得同时含2b和HC-Pro基因反向重复片段的重组质粒pBIN-2b (r, i)-HC (r, i)。3.转基因阳性烟草植株的获得3种植物表达载体pBIN-2b (r)-In-2b (i)、pBIN-HC (r)-In-HC (i)和pBIN-2b (r, i)-HC (r, i)分别转化农杆菌EHA105,叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum)品种云烟85,经预培养、农杆菌浸润、分化培养和生根培养,最终获得3种卡那抗性再生植株。对抗性再生植株进行PCR检测,获得了转2b基因、HC-Pro基因以及融合2b和HC-Pro基因反向重复片段的T0代转基因阳性植株。4. T0代转基因烟草植株的抗病性鉴定转2b基因的烟草植株接种CMV,转HC-Pro基因的烟草植株接种PVY,转融合2b和HC-Pro基因的烟草植株接种CMV和PVY,通过生物学症状观察和间接ELISA检测,分别获得单独抗CMV、单独抗PVY以及双抗CMV和PVY的T0代转基因烟草植株。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-10
文献综述  10-20
  1 黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y 病毒(PVY)的研究现状  10-15
    1.1 黄瓜花叶病毒的生物学特性与基因组结构特征  10-12
      1.1.1 黄瓜花叶病毒的生物学特性  10-11
      1.1.2 黄瓜花叶病毒基因组的结构与功能  11-12
      1.1.3 CMV 2b 基因的功能研究  12
    1.2 马铃薯Y 病毒的生物学特性与基因组结构特征  12-14
      1.2.1 马铃薯Y 病毒的生物学特性  12-13
      1.2.2 马铃薯Y 病毒的基因组结构与功能  13-14
      1.2.3 PVY Hc-pro 基因的功能研究  14
    1.3 植物抗CMV 和PVY 转基因工程研究进展  14-15
      1.3.1 CMV 转基因抗病毒基因工程研究  14-15
      1.3.2 PVY 转基因抗病毒基因工程研究  15
  2 植物病毒与RNA 沉默  15-20
    2.1 RNA 沉默的机制  15-17
    2.2 RNA 沉默与植物抗病毒特性  17
    2.3 植物病毒对RNA 沉默的抑制  17-18
    2.4 RNA 沉默的植物病毒抑制子  18
    2.5 构建反向重复产生dsRNA 可以介导高效基因沉默  18-20
引言  20-22
材料与方法  22-34
  1 供试材料  22
    1.1 病样采集  22
    1.2 植物材料  22
    1.3 病毒毒源  22
    1.4 菌种和载体  22
    1.5 酶和化学试剂  22
    1.6 常用缓冲溶液和培养基  22
    1.7 抗生素  22
    1.8 仪器设备  22
  2 试验方法  22-34
    2.1 植物病毒的ELISA 检测  22-23
    2.2 DNA 分子操作常用方法  23-27
      2.2.1 CTAB 法抽提总DNA  23-24
      2.2.2 叶片总RNA 的提取  24
      2.2.3 DNase 消化处理  24-25
      2.2.4 cDNA 的合成  25
      2.2.5 PCR 技术  25-26
      2.2.6 RT-PCR 扩增技术  26-27
    2.3 PCR 产物的克隆和序列分析  27-29
      2.3.1 PCR 产物回收和纯化  27
      2.3.2 PCR 产物的连接  27
      2.3.3 感受态细胞的制备  27-28
      2.3.4 连接产物的转化  28
      2.3.5 重组质粒的筛选  28-29
      2.3.6 重组质粒的鉴定  29
      2.3.7 克隆基因的序列测定、分析和登录  29
    2.4 CMV RNA2 部分片段的获得  29-30
      2.4.1 CMV RNA2 部分片段引物的设计与合成  29
      2.4.2 cDNA 的合成及CMV RNA2 部分片段的的克隆  29-30
      2.4.3 序列测定和序列分析  30
    2.5 反向重复植物表达载体的构建  30-32
      2.5.1 CMV 2b 基因正、反向片段的获得  30
      2.5.2 CMV 2b 基因反向重复植物表达载体的构建  30-32
      2.5.3 融合CMV 2b 和HC-Pro 两个反向重复植物表达载体的构建  32
    2.6 反向重复植物表达载体导入农杆菌(液氮冻融法)  32
    2.7 烟草转化及卡那霉素抗性植株的再生  32-33
    2.8 转基因烟草阳性植株的检测  33
    2.9 转基因烟草植株T_0 代的抗病性鉴定  33-34
结果与分析  34-45
  1 病毒的ELISA 检测结果  34
  2 CMV RNA2 部分片段的克隆、测序和序列分析  34-35
    2.1 CMV RNA2 部分片段的克隆和测序  34
    2.2 不同来源CMV 2b基因的序列比较及分子进化分析  34-35
  3 反向重复植物表达载体的构建  35-38
    3.1 CMV 2b基因正、反向片段的克隆  35-36
    3.2 CMV 2b反向重复植物表达载体的构建  36-37
    3.3 融合CMV 2b和HC-Pro 两个反向重复植物表达载体的构建  37-38
  4 烟草的转化和卡那抗性植株的获得  38-40
  5 转基因烟草阳性植株的检测  40-41
  6 转基因烟草植株T_0 代的抗病性鉴定  41-45
讨论  45-47
结论  47-48
参考文献  48-55
附录A:常用缓冲液及培养基配方法  55-59
附录B:常用的抗生素和激素及使用浓度  59-60
附录C:常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器  60-62
附录D:本文所用的重要缩写词及中文对照  62-63
致谢  63-64
作者简介  64
[附]在读期间发表论文  64

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵(传)染性病害 > 病毒
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