学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示
dsRNA介导的烟草抗黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y病毒(PVY)研究
作 者: 宋培培
导 师: 江彤
学 校: 安徽农业大学
专 业: 植物病理学
关键词: CMV 2b基因 PVY HC-Pro基因 反向重复表达载体 基因沉默 抗病毒 转基因烟草
分类号: S432.41
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
下 载: 105次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
内容摘要
RNA沉默是植物体内固有的一种抗病毒防卫反应,而大多数植物病毒编码的RNA沉默抑制子可以克服这种寄主的防卫反应。本研究利用转录后基因沉默原理,分别构建含沉默抑制子CMV 2b基因、PVY HC-Pro基因部分片断以及融合2b和HC-Pro基因部分片段反向重复的植物表达载体,通过在植物体内形成dsRNA沉默目标基因2b和HC-Pro,获得了单独抗CMV、单独抗PVY以及双抗CMV和PVY的云烟85转基因烟草植株,明确了dsRNA介导的转基因抗病毒基因工程策略的可行性。1. CMV 2b基因的克隆和序列分析从安徽亳州采集表现明显CMV症状的烟草样本, RT-PCR扩增CMV RNA2部分片段,克隆并测序。其中包含的2b基因全长336个核苷酸,编码111个氨基酸。序列比对表明,来源于安徽烟草的CMV 2b基因与来源于韩国的2b基因AF033667的核苷酸序列相似性最高,达98.8 %。构建2b基因系统关系树,也表明来源于安徽烟草的CMV 2b基因与AF033667亲缘关系最近。2.反向重复植物表达载体的构建1)2b基因部分片断反向重复表达载体的构建以安徽CMV 2b为模板,分别扩增大小约为300 bp的正向片段2b (r)和反向片段2b (i)。先后将反向片段2b (i)和正向片段2b (r)分别插入载体pSK-In所含intron两侧,获得重组质粒pSK-2b (r)-In-2b (i)。再将含intron的正反向片段插入pBIN438,最终得到含2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b (r)-In-2b (i)。2)HC-Pro基因部分片段反向重复表达载体的构建(见陈伟论文)3)融合2b和HC-Pro基因部分片段反向重复表达载体的构建将HC-Pro基因部分序列反向重复片段插入质粒pBIN-2b (r)-In-2b (i),最终获得同时含2b和HC-Pro基因反向重复片段的重组质粒pBIN-2b (r, i)-HC (r, i)。3.转基因阳性烟草植株的获得3种植物表达载体pBIN-2b (r)-In-2b (i)、pBIN-HC (r)-In-HC (i)和pBIN-2b (r, i)-HC (r, i)分别转化农杆菌EHA105,叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum)品种云烟85,经预培养、农杆菌浸润、分化培养和生根培养,最终获得3种卡那抗性再生植株。对抗性再生植株进行PCR检测,获得了转2b基因、HC-Pro基因以及融合2b和HC-Pro基因反向重复片段的T0代转基因阳性植株。4. T0代转基因烟草植株的抗病性鉴定转2b基因的烟草植株接种CMV,转HC-Pro基因的烟草植株接种PVY,转融合2b和HC-Pro基因的烟草植株接种CMV和PVY,通过生物学症状观察和间接ELISA检测,分别获得单独抗CMV、单独抗PVY以及双抗CMV和PVY的T0代转基因烟草植株。
|
全文目录
摘要 4-6 Abstract 6-10 文献综述 10-20 1 黄瓜花叶病毒(CMV)和马铃薯Y 病毒(PVY)的研究现状 10-15 1.1 黄瓜花叶病毒的生物学特性与基因组结构特征 10-12 1.1.1 黄瓜花叶病毒的生物学特性 10-11 1.1.2 黄瓜花叶病毒基因组的结构与功能 11-12 1.1.3 CMV 2b 基因的功能研究 12 1.2 马铃薯Y 病毒的生物学特性与基因组结构特征 12-14 1.2.1 马铃薯Y 病毒的生物学特性 12-13 1.2.2 马铃薯Y 病毒的基因组结构与功能 13-14 1.2.3 PVY Hc-pro 基因的功能研究 14 1.3 植物抗CMV 和PVY 转基因工程研究进展 14-15 1.3.1 CMV 转基因抗病毒基因工程研究 14-15 1.3.2 PVY 转基因抗病毒基因工程研究 15 2 植物病毒与RNA 沉默 15-20 2.1 RNA 沉默的机制 15-17 2.2 RNA 沉默与植物抗病毒特性 17 2.3 植物病毒对RNA 沉默的抑制 17-18 2.4 RNA 沉默的植物病毒抑制子 18 2.5 构建反向重复产生dsRNA 可以介导高效基因沉默 18-20 引言 20-22 材料与方法 22-34 1 供试材料 22 1.1 病样采集 22 1.2 植物材料 22 1.3 病毒毒源 22 1.4 菌种和载体 22 1.5 酶和化学试剂 22 1.6 常用缓冲溶液和培养基 22 1.7 抗生素 22 1.8 仪器设备 22 2 试验方法 22-34 2.1 植物病毒的ELISA 检测 22-23 2.2 DNA 分子操作常用方法 23-27 2.2.1 CTAB 法抽提总DNA 23-24 2.2.2 叶片总RNA 的提取 24 2.2.3 DNase 消化处理 24-25 2.2.4 cDNA 的合成 25 2.2.5 PCR 技术 25-26 2.2.6 RT-PCR 扩增技术 26-27 2.3 PCR 产物的克隆和序列分析 27-29 2.3.1 PCR 产物回收和纯化 27 2.3.2 PCR 产物的连接 27 2.3.3 感受态细胞的制备 27-28 2.3.4 连接产物的转化 28 2.3.5 重组质粒的筛选 28-29 2.3.6 重组质粒的鉴定 29 2.3.7 克隆基因的序列测定、分析和登录 29 2.4 CMV RNA2 部分片段的获得 29-30 2.4.1 CMV RNA2 部分片段引物的设计与合成 29 2.4.2 cDNA 的合成及CMV RNA2 部分片段的的克隆 29-30 2.4.3 序列测定和序列分析 30 2.5 反向重复植物表达载体的构建 30-32 2.5.1 CMV 2b 基因正、反向片段的获得 30 2.5.2 CMV 2b 基因反向重复植物表达载体的构建 30-32 2.5.3 融合CMV 2b 和HC-Pro 两个反向重复植物表达载体的构建 32 2.6 反向重复植物表达载体导入农杆菌(液氮冻融法) 32 2.7 烟草转化及卡那霉素抗性植株的再生 32-33 2.8 转基因烟草阳性植株的检测 33 2.9 转基因烟草植株T_0 代的抗病性鉴定 33-34 结果与分析 34-45 1 病毒的ELISA 检测结果 34 2 CMV RNA2 部分片段的克隆、测序和序列分析 34-35 2.1 CMV RNA2 部分片段的克隆和测序 34 2.2 不同来源CMV 2b基因的序列比较及分子进化分析 34-35 3 反向重复植物表达载体的构建 35-38 3.1 CMV 2b基因正、反向片段的克隆 35-36 3.2 CMV 2b反向重复植物表达载体的构建 36-37 3.3 融合CMV 2b和HC-Pro 两个反向重复植物表达载体的构建 37-38 4 烟草的转化和卡那抗性植株的获得 38-40 5 转基因烟草阳性植株的检测 40-41 6 转基因烟草植株T_0 代的抗病性鉴定 41-45 讨论 45-47 结论 47-48 参考文献 48-55 附录A:常用缓冲液及培养基配方法 55-59 附录B:常用的抗生素和激素及使用浓度 59-60 附录C:常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器 60-62 附录D:本文所用的重要缩写词及中文对照 62-63 致谢 63-64 作者简介 64 [附]在读期间发表论文 64
|
相似论文
- 利用RNAi提高烟草对病毒的抗性及岷江百合遗传转化体系的初步构建,S435.72
- 小麦黄花叶病毒(WYMV)RNA2编码基因的功能研究,S435.121
- 超表达OsSsr1基因烟草的获得及其抗逆性分析,S572
- 新型含氟化合物的合成及对TMV的诱导抗性研究,S435.72
- 主栽抗病品种对RSV的抗性特征和抗病转基因水稻材料的创制,S511
- 转小麦类蛋白激酶基因TA50-10烟草及其抗病性分析,S572
- PCV2分离株增殖特性研究及板蓝根多糖、黄芪多糖对PCV2体外复制的影响,S858.28
- 慢病毒载体介导的RNAi特异性沉默猪Myostatin基因的研究,S828
- 不结球白菜抗坏血酸合成相关基因的克隆与表达及BcPMI2的功能分析,S634.3
- 转IRF-1基因牛胎儿成纤维细胞的BVDV及IBRV抗性研究,S823
- 青枯菌PopW蛋白诱导植物抗病功能研究及其转基因烟草的构建,S572
- 荷花液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白基因NnNHX1的克隆及转基因烟草耐盐性的初步分析,S682.32
- RNAi技术抗呼吸道合胞病毒的实验研究,R725.6
- 植物天冬酰胺合成酶基因的抗病性调控功能分析,S511
- 靶向Survivin基因的siRNA对结肠癌作用的实验研究,R735.35
- HCV单独感染者与HIV/HCV共感染者HCV病毒负荷和基因亚型研究,R512.63
- 木芙蓉叶总黄酮的提取纯化及其药效学的研究,R284
- 新型氮连核苷类衍生物的合成及活性评价,TQ460.1
- 天蚕素A-蛙皮素杂合肽、抗菌肽DermaseptinS4、丽蝇抗病毒肽Alloferon1体外抗病毒活性研究,S859.1
- 转基因创建矮牵牛、烟草早花种质资源的研究,S572
- 高温胁迫对转甜椒甘油-3-磷酸酰基转移酶基因烟草PSⅡ光化学活性的影响,S572
中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵(传)染性病害 > 病毒
© 2012 www.xueweilunwen.com
|