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自噬溶酶体途径在大鼠脑永久性缺血损伤引起的神经细胞死亡中的作用及机制

作　者: 温雅丹
导　师: 秦正红；张慧灵
学　校: 苏州大学
专　业: 药理学
关键词: 脑中风自噬溶酶体神经保护凋亡 3-MA cathepsin B inhibitor LC3 cathepsin B Bcl-2
分类号: R743
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的:观察大鼠永久性局灶性缺血性脑损伤对自噬-溶酶体的激活,探讨抑制自噬溶酶体途径对大鼠永久性局灶性缺血性脑损伤的保护作用,以及对抗凋亡蛋白Bcl-2的作用。方法:采用线拴法制作大鼠永久性大脑中动脉梗塞(permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO)模型。用电镜观察大鼠永久性局灶性缺血性脑损伤对自噬-溶酶体的激活。3-MA (150-600 nmol),cathepsin B inhibitor (CBI) (5-10μg)侧脑室注射给药,以脑梗塞体积、脑水肿、行为学症状等指标评价对缺血性脑损伤的影响。采用western blot法和免疫组化法检测pMCAO大鼠缺血半球皮层中自噬溶酶体相关蛋白及凋亡相关蛋白的表达。结果:电镜观察显示缺血早期的神经细胞,即可发现自噬小体产生,溶酶体电子密度增加,线粒体和内质网肿胀,在缺血后期,镜下神经细胞表现为凋亡或坏死。3-MA (300和600 nmol)或CBI (7.5和10μg)均可显著改善pMCAO行为障碍,减小脑梗塞体积,减轻脑水肿(P<0.05)。Western blot及免疫组化结果显示,脑缺血0h、1h、3h、6h、12h、24h后,大鼠大脑缺血半球皮层内LC3和cathepsin B的表达(P<0.05)可在短期内迅速增加,在3h达到高峰,6h表达仍较高,但表达已开始减弱(P<0.05)。同时还检测了Beclin 1的表达水平,在1h就迅速升高,达到峰值,3h表达仍然较高(P<0.05)。选择3h作为给药时间点,同样观测LC3、Beclin 1和cathepsin B的表达情况,发现给予3-MA (600 nmol)或CBI (10μg)能显著降低LC3、Beclin 1和cathepsin B的表达(P<0.05),减少永久性局灶性缺血损伤引发的细胞死亡,有神经保护作用。同时我们还检测了该时间点的Bcl-2的表达,发现表达水平降低(P<0.05),但给与3-MA (600 nmol)或CBI (10μg)后,能使Bcl-2的表达恢复至正常水平(P<0.05)。结论:1.大鼠局灶性缺血行脑损伤能激活自噬-溶酶体发生,且早于凋亡和细胞坏死前发生。2.大剂量和中剂量3-MA对大鼠局灶性缺血性脑损伤有一定的保护作用。3.大剂量和中剂量CBI对大鼠局灶性缺血性脑损伤有一定的保护作用。4. 3-MA和CBI对大鼠局灶性缺血性脑损伤的保护作用,可能是通过抑制LC3、cathepsin B等的表达,即通过抑制自噬-溶酶体途径来实现的。5. 3-MA和CBI对大鼠局灶性缺血性脑损伤的保护作用,还可能通过提高Bcl-2表达,即提高抗凋亡蛋白的表达来完成。

全文目录

中文提要  3-5
Abstract  5-9
前言  9-20
  一. 本课题研究的理论基础及国内外研究现状  9-18
  二. 本课题的创新点  18-19
  三. 本课题的研究意义及价值  19-20
第一部分大鼠永久性局灶性缺血性脑损伤对自噬－溶酶体的激活情况  20-25
  材料和方法  21-23
  结果  23-24
  小结  24-25
第二部分 3-MA, CBI 对pMCAO 大鼠的神经保护作用  25-38
  第一节 3-MA 对pMCAO 大鼠的神经保护作用  25-32
    材料和方法  25-29
    结果  29-32
    小结  32
  第二节 CBI 对pMCAO 大鼠的神经保护作用  32-38
    材料和方法  33-35
    结果  35-37
    小结  37-38
第三部分 3-MA, CBI 对pMCAO 大鼠的神经保护作用的分子机制  38-54
  第一节 3-MA, CBI 对pMCAO 大鼠的神经保护作用与自噬－溶酶体途径的关系  38-51
    一 pMCAO 大鼠大脑缺血半球皮层LC3、Beclin 1、cathepsin B 蛋白水平表达的时程变化  39-47
    二 3-MA, CBI 对pMCAO 大鼠大脑缺血半球皮层LC3，Beclin 1，cathepsin B蛋白水平表达的影响  47-51
  第二节 3-MA, CBI 对pMCAO 大鼠的神经保护作用与凋亡相关蛋白Bcl-2 的关系  51-54
    材料与方法  51-52
    结果  52-53
    小结  53-54
讨论  54-58
结论  58-59
参考文献  59-68
攻读硕士学位期间发表的论文  68-69
附录一综述  69-81
附录二缩略词  81-82
致谢  82-83

自噬溶酶体途径在大鼠脑永久性缺血损伤引起的神经细胞死亡中的作用及机制

内容摘要

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