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GFP+小鼠胚胎干细胞ESD3大鼠脑内移植的相关研究

作　者: 鲁文果
导　师: 张苏明
学　校: 华中科技大学
专　业: 神经科
关键词: 小鼠胚胎干细胞绿色荧光蛋白移植大鼠分化存活
分类号: R741
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

目的:(1)全能(totipotent)区域非特异性(regionally non-specified)的胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)是研究成体不同脑区控制干细胞分化能力的一个十分有力的工具。为了了解成体脑组织对胚胎干细胞的影响及胚胎干细胞在成体脑内的一系列行为,我们将少量未分化小鼠胚胎干细胞移植入成体大鼠脑内几个不同部位,以探讨未分化的小鼠胚胎干(mouse embryonic stem, mES)细胞在成体大鼠大脑内各个部位的存活,生长与分化的潜能的差异。(2)在病理条件下,脑内的局部环境会发生改变,其形成的特殊环境会影响移植胚胎干细胞的行为。为了了解脑出血时的脑内环境对胚胎干细胞的影响,我们将未分化小鼠胚胎干细胞移植入脑出血大鼠模型脑内,初步研究小鼠胚胎干细胞在脑出血大鼠脑内的存活与分化。(3)同时通过本系列实验,可以暴露出一些在胚胎干细胞乃至其他种类干细胞移植应用研究中将面临的问题,为进一步进行干细胞移植研究打下基础。方法:将小鼠胚胎干细胞用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记,经G418筛选一月使其稳定表达。(1)我们将少量转绿色荧光蛋白未分化小鼠胚胎干细胞移植入成体大鼠脑内不同部位,分别于移植后5天,14天和28天后处死大鼠,进行形态学观察及免疫荧光定性检测,以了解未分化小鼠胚胎干细胞在大鼠脑内不同区域的存活,生长与分化情况。(2)制作大鼠脑出血模型,三天后移植GFP﹢胚胎干细胞至出血灶对侧侧脑室内及对照健康大鼠侧脑室内,一月后处死大鼠,行免疫荧光染色鉴定后,通过荧光显微镜观察小鼠胚胎干细胞,了解其分化生长情况。结果:(1)移植入完整大鼠大脑中的未分化小鼠胚胎干细胞可逐步迁徙入大鼠脑组织。移植细胞及其后裔在海马生长最为旺盛,而隔区最差(p<0.01)。移植细胞数量对其生存状态有一定的影响,移植细胞数量过多,移植部位脑组织破坏重,细胞坏死多;而移植细胞数量太少则由于免疫反应的存在,保证不了最终移植物的存在。移植细胞与接受移植的器官的相对体积比例也是一个重要影响因素,针对不同的疾病所需要移植的不同部位必须区别对待。移植胚胎干细胞可向nestin-ir(immune reactive)神经干细胞分化,移植细胞分化为神经干细胞的效率也有位置差异,海马最高,而隔区最低(p<0.01)。在各移植部位均发现有移植细胞来源的终末分化细胞,即神经元和胶质细胞,尤其在海马,可见有大量的移植胚胎干细胞向神经元分化。(2)小鼠胚胎干细胞脑内移植至大鼠侧脑室后能有效穿透脑室壁,进入脑组织,向病灶方向迁徙,脑出血增加了移植入侧脑室的GFP+小鼠胚胎干细胞进入脑实质的数量(p<0.01)。因为供体细胞突破侧脑室壁的部位不尽相同,并沿脑室向病灶方向迁徙,细胞分化情况很复杂。我们发现对照组分化较为明显,尤其是迁移入海马组织的可高比例的分化为nestin-ir细胞;相反卒中组移植细胞则多无神经相关标记的表达,存活细胞周围可见大量宿主来源的反应性星型胶质细胞。迁移至病灶周围的细胞也有分化为nestin-ir的。在nestin-ir细胞分布区还间杂着数量不等的NeuN+( neuronal nuclei protein)与GFAP+( glial fibrillary acidic protein)的移植细胞,即移植细胞可向神经元与神经胶质细胞等终末细胞分化。结论:(1)只有部分脑区构成适合胚胎干细胞及其后裔生存,并促进其分化的有益环境。因此,位置特异的微环境因子及环境对移植细胞的影响,凸现了宿主组织特性在决定细胞替代治疗中枢神经系统疾病的策略中的重要性,以及在治疗时调控移植部位微环境以利于移植细胞生存的可能性。(2)脑卒中增加了移植细胞由脑室进入脑实质的细胞量,但是降低了胚胎干细胞细胞分化为神经系细胞的效率。(3)未分化小鼠胚胎干细胞无论在健康大鼠或脑出血大鼠脑内都能存活,且具有穿越脑室壁,进入脑实质内存活的能力;同时细胞有能力向终末神经细胞包括神经元与神经胶质细胞分化。

全文目录

中英文对照  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
正文  12-46
  前言  12-15
    参考文献  14-15
  第一部分未分化小鼠胚胎干细胞移植入成体正常大鼠脑内的位置特异性生长  15-35
    概述  15-16
    1、材料  16-17
    2、实验方法  17-24
    3、结果  24-27
    4、讨论  27-31
    参考文献  31-35
  第二部分 GFP+小鼠胚胎干细胞移植入脑出血大鼠脑内后存活与分化的研究  35-43
    概述  35
    1、材料  35-36
    2、实验方法  36-37
    3、结果  37-39
    4、讨论  39-41
    参考文献  41-43
  小结  43-45
  工作展望  45-46
综述  46-58
致谢  58

GFP+小鼠胚胎干细胞ESD3大鼠脑内移植的相关研究

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