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将蜈蚣草植物螯合肽合成酶基因（PvPCS1）转入拟南芥中的研究

作　者: 王奋飞
导　师: 董瑞斌；杨仲南
学　校: 南昌大学
专　业: 环境科学
关键词: 砷 植物修复 植物螯合肽合成酶 PvPCS1 转基因
分类号: X173
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


随着人类活动和工业技术的不断发展，重金属在土壤中的含量越来越高。重金属污染已日益成为威胁人类健康和人类生活质量的严重社会问题和环境问题。砷是自然界存在的一种含量较丰富、常以化合物的形态存在的重金属，具有很强的毒性，并且具有致畸、致癌和致突变效应。美国国家环保总局早已将其划归为A类致癌物。近年来，大量的砷随人类活动和工业发展进入土壤环境。砷污染已经成为公众普遍关注的污染物之一。近年来发展起来的植物修复技术由于成本低、效果好、具有环境友好性等特点，逐渐成为重金属污染治理的研究和应用热点。特别是第一种砷超富集植物蜈蚣草（Pteris vittata L.）的发现，利用植物修复砷污染土壤成为一种可行的途径。并且蜈蚣草几乎成为砷超富集植物研究中的模式植物，众多学者对其从物理、化学、生物、生理进行分析研究，希望能够为砷污染土壤的植物修复工程的应用提供理论基础和科学依据。但是由于蜈蚣草为蕨类植物，具有生长缓慢的缺点。随着分子生物学和基因工程技术的发展，完全有可能在现有的砷超富集植物研究的基础上构建转基因植物，使其具有富集砷的特性，同时具有大的生物量，能够高效地的应用到植物修复工程中。近年来对植物富集重金属的关键基因—植物螯合肽合成酶基因的研究使得构建具有超富集重金属的转基因植物的可能性大大增加。本研究通过克隆蜈蚣草植物螯合肽合成酶基因，与烟草花椰菜中强表达启动子CaMV 35S启动子融合，构建过量表达载体pMON530-PvPCS1，然后将其导入到野生型拟南芥中，再通过遗传筛选，T0代种子在干燥处理后，在涂布有卡那霉素抗性（Kmr，50ug／ml）的PNS固体培养基上，得到了72株阳性植株得到稳定表达的转基因植株。再经PCR鉴定，最终得到69株转基因植株。RT-PCR结果显示PvPCS1基因在拟南芥中可以稳定表达。实验数据说明蜈蚣草植物螯合肽合成酶基因PvPCS1基因已经成功转入拟南芥，并在拟南芥中高效表达。这项工作的意义在于构建稳定地外源表达PvPCS1的转基因植物，然后对该基因的功能进行分析。截至目前，我们已经得到T1代种子，接下来的工作将是继续筛选转基因植株的纯系植株，以进行转基因植物对砷的敏感性及抗性实验，以及其的富集能力。最终目的建立PvPCS1稳定的外源表达系统，构建可以用于砷污染土壤植物修复的工程植物。本项研究是该项目实施的第一步，该结果也为进一步的研究分析奠定了坚实的基础。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章 引言  10-11
第二章 土壤砷污染  11-14
  2.1 引言  11
  2.2 砷的来源和种类  11-12
    2.2.1 自然环境中的As  11-12
    2.2.2 人为活动环境中的As  12
  2.3 As的土壤地球化学特性  12-13
  2.4 As的毒性及危害  13-14
第三章 植物修复理论与分子机制  14-31
  3.1 植物修复理论  14-19
    3.1.1 引言  14
    3.1.2 植物修复技术的概念和基本原理  14-19
  3.2 植物修复的应用现状和展望  19-23
    3.2.1 植物修复技术的应用  19-21
    3.2.2 植物修复技术的优点与不足  21-22
    3.2.3 植物修复应用现状及研究进展  22-23
  3.3 植物修复的分子机制  23-31
    3.3.1 植物重金属抗性机制  23-24
    3.3.2 植物螯合肽(phytochelatins,PCs)  24-27
    3.3.3 PCs类复合物与植物重金属抗性的关系  27-29
    3.3.4 PCs生物合成基因的分离  29-31
第四章 砷超富集植物研究进展  31-36
  4.1 砷超富集植物的定义及评价标准  31-33
    4.1.1 砷超富集植物的定义  31-32
    4.1.2 关于砷超富集植物评价标准的讨论  32-33
  4.2 砷超富集植物种质资源  33-36
第五章 植物修复的基因技术  36-42
  5.1 引言  36
  5.2 植物修复基因技术的研究方法  36-37
  5.3 转基因技术实施的分子生物学途径  37-40
    5.3.1 提高根际金属离子的生物利用率的研究  37-38
    5.3.2 金属离子膜转运蛋白基因的研究  38
    5.3.3 应用植物对金属离子的生物转化与挥发作用  38-39
    5.3.4 过量合成植物螯合肽的研究  39-40
  5.4 提高转基因植物修复效率的方法  40-41
  5.5 转基因植物用于植物修复面临的问题和展望  41-42
第六章 本项研究的提出和意义  42-45
  6.1 本研究的提出  42-43
  6.2 本项研究的意义  43-44
  6.3 关于本研究的开展  44-45
第七章 实验材料和方法  45-60
  7.1 实验材料  45-46
    7.1.1 植物材料  45
    7.1.2 质粒和菌株  45
    7.1.3 工具酶和生化试剂  45
    7.1.4 主要仪器  45-46
    7.1.5 生物软件和数据库  46
  7.2 实验方法  46-60
    7.2.1 植物材料的种植  46-47
    7.2.2 RNA的提取与RT-PCR  47-50
    7.2.3 PCR产物回收纯化  50-51
    7.2.4 PCR产物T-A克隆  51
    7.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备  51-52
    7.2.6 大肠杆菌的热激转化  52
    7.2.7 转化子的验证  52-53
    7.2.8 大肠杆菌质粒DNA的小量制备  53-54
    7.2.9 根癌农杆菌ASE感受态细胞的制备  54
    7.2.10 农杆菌的转化  54-55
    7.2.11 农杆菌转化子的鉴定  55
    7.2.12 植物材料的遗传转化及转化子筛选  55-56
    7.2.13 转基因植株的鉴定  56-60
第八章 实验结果与分析  60-64
  8.1 蜈蚣草总RNA和cDNA的获得  60
  8.2 PvPCS1基因的克隆  60-61
  8.3 PvPCS1过量表达载体的构建  61-62
  8.4 转基因植株的筛选  62-63
  8.5 转基因植株的分子鉴定  63-64
    8.5.1 T_1代植株的PCR鉴定  63
    8.5.2 T1代植物的RT-PCR鉴定  63-64
第九章 讨论与展望  64-66
  9.1 本研究的主要结论  64
  9.2 本研究中的主要难点  64-65
  9.3 有待进一步研究的问题  65-66
致谢  66-67
参考文献  67-76
附录A  76-77
附录B  77-78
攻读学位期间的研究成果  78

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 环境植物学
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