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AtPCS1基因的克隆及其农杆菌介导的苜蓿遗传转化

作　者: 吴亦亮
导　师: 陈亮
学　校: 厦门大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 拟南芥植物螯合肽合成酶苜蓿植物修复
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 201次
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内容摘要

利用植物修复重金属污染土壤是一种廉价并且可行的修复技术。大部分已发现的超富集植物生物量小,限制了其在植物修复方面的应用。本实验借助基因工程手段将重金属富集、耐受相关的基因AtPCS1转入生物量大且适应性广的苜蓿中,以期获得能够富集重金属的苜蓿,为今后的工作提供基础材料。首先,比较了六种不同基因型苜蓿(阿尔岗金、三得利、陇东、甘农一号、大花及天兰)愈伤组织的形成及分化能力。以叶片为外植体,在含1.0 mg/L 2,4-D、0.1 mg/L KT的B5培养基上诱导胚性愈伤组织,将愈伤组织置于无激素的B5培养基上诱导植株再生。六种不同基因型的苜蓿愈伤形成率均在90%以上,品种对苜蓿愈伤组织形成能力差异并不显著(P>0.05)。不同品种苜蓿的分化率并不高(0-42.9%),其中甘农一号分化率最高(42.9%),品种间分化率存在显著差异(P<0.05)。进一步比较了甘农一号叶片、下胚轴及子叶等不同外植体的分化再生能力,不同外植体分化能力差异不显著,但是叶片起源的愈伤组织分化时间短,且其丛生芽形成数量高于下胚轴和子叶。再生芽在B5培养基上成苗并在蔗糖浓度为10 g/L的1/2 MS培养基上顺利生根。从愈伤组织的诱导到分化形成再生苗总共约80-100 d。对于我们所选的再生体系,甘农一号叶片是适于做苜蓿遗传转化的理想材料。通过植物螯合肽同重金属结合形成复合物,进而输送到液泡中隔离是植物对吸收的重金属进行解毒的重要途径。植物螯合肽合成酶是植物螯合肽合成途径的关键酶。通过RT-PCR,克隆拟南芥植物螯合肽合成酶(AtPCS1)基因,构建原核表达载体pET28a-AtPCS1。转化大肠杆菌BL21(DE3),0.75 mM IPTG诱导融合蛋白His-AtPCS1表达,将其纯化后采用皮下多点注射免疫的方法免疫BALB/C小鼠,获得特异性抗血清。抗血清同纯化的融合蛋白及拟南芥总蛋白的western-blot结果表明制备的抗血清具有较高的活性和一定的特异性。为进一步研究PCS在植物体内的分布及不同组织表达上的差异性,获得可用于重金属污染土壤的生物修复的转基因植物做准备。进一步,构建了AtPCS1的植物表达载体pBI121-AtPCS1,转化农杆菌EHA105。通过叶盘法以重组的农杆菌侵染甘农一号叶片,在50 mg/L Kan的筛

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
第一篇文献综述  12-23
  第一章植物修复  12-18
    1 超富集植物及其对重金属的耐性机理  12-15
    2 超富集植物特点及植物修复  15
    3 植物修复中的转基因技术  15-16
    4 植物螯合肽及其在植物修复中的作用  16-18
  第二章苜蓿遗传转化研究进展  18-21
    1 苜蓿再生体系的研究进展  18-20
    2 苜蓿的遗传转化  20-21
  第三章研究的意义、内容  21-23
第二篇研究报告  23-55
  第一章 AtPC51基因克隆、原核表达及其多抗血清的制备  23-34
    1 材料与方法  23-28
    2 实验结果  28-32
      2.1 AtPC51 基因的克隆  28-29
      2.2 原核表达载体pET28a-AtPC51 的构建  29-30
      2.3 融合蛋白的诱导表达及纯化  30
      2.4 抗体的制备与鉴定  30-32
    3 讨论  32-34
  第二章苜蓿再生体系的优化  34-42
    1 材料与方法  34-35
    2 实验结果  35-39
      2.1 品种对植株再生的影响  35-37
      2.2 不同外植体对植株再生的影响  37-39
      2.3 培养基对再生植株生根的影响  39
    3 讨论  39-42
  第三章农杆菌介导的 AtPC51 基因的苜蓿遗传转化  42-54
    1 材料与方法  42-46
    2 实验结果  46-51
      2.1 AtPC51 植物表达载体的构建及农杆菌转化子的鉴定  46-47
      2.2 Kan 选择压的确定  47-48
      2.3 AtPC51 基因导入苜蓿及植株再生  48-50
      2.4 转基因植株PCR 鉴定  50-51
    3 讨论  51-54
  第四章总结  54-55
参考文献  55-61
缩略词  61-62
致谢  62

AtPCS1基因的克隆及其农杆菌介导的苜蓿遗传转化

内容摘要

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