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重组大肠杆菌高效生产可溶性的人β防御素

作　者: 王芳
导　师: 徐志南
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化工
关键词: 人防御素人β防御素2(HBD-2) 人β防御素3(HBD-3) 人β防御素4(HBD-4) 重组大肠杆菌融合表达密码子优化重复序列质粒稳定性发酵抑菌活性
分类号: TQ464
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

人β防御素-2(HBD-2)是一种由41个氨基酸组成并富含半胱氨酸残基的阳离子抗菌短肽，内有三个二硫键。它具有广泛的抗菌谱，尤其对革兰氏阴性菌和酵母有很强的杀伤作用；而且致病微生物不会对它产生耐药性，因此有很好的药用前景。本文的目的在于实现HBD-2在大肠杆菌内的高效表达，研究内容包括重组表达体系的构建和筛选，发酵条件的优化及放大，抗菌活性的初步检测，以及同族的HBD-3和HBD-4的重组表达。首先基于pET-28a(+)、pQE30、pBV220、pGEX-4T-2、pET-32a(+)、pMAL-p2表达系统，以经过密码子优化的HBD-2前体编码序列(shBD2)及其重复序列作为目的基因，构建了一系列表达载体。通过对产物的表达水平和可溶性的比较，确定携带TRX作为载体蛋白的pET32-shBD2为最适的表达载体。针对不同拷贝数shBD2基因表达水平的差异，考察了重复序列对于菌体生长和质粒稳定性的影响，发现含较少拷贝数shBD2基因的重组菌在生长和质粒稳定性上有明显优势，而且培养基中添加葡萄糖可以改善携带较多shBD2基因的重组菌的生长状况和质粒的不稳定性。另外，对不同来源的hBD2基因用pET-32a(+)系统的表达比较证明了密码子的优化可以有效提高HBD-2在大肠杆菌中的表达水平。随后对重组菌E.coli BL2l(DE3)／pET32-shBD2的摇瓶发酵条件进行了优化。通过三种培养基的对比实验，确定MBL为最适培养基。实验结果表明降低培养温度可以显著提高目的蛋白的可溶性，发酵温度为28℃时目的蛋白可溶表达效果和发酵时间长度最佳。最适摇瓶装液量为12％(v／v)。诱导条件对HBD-2融合蛋白的表达有重要影响，对数生长中期为最适的诱导时间，诱导剂IPTG的最适浓度为0.8mM，诱导后表达8hr终止发酵。在最适条件下发酵所得可溶目的蛋白溶解性高达92.3％，产量达到1.3g／L。在摇瓶发酵研究的基础上，成功实现了在10L发酵罐上的发酵。得到有生物活性的产物是进行HBD-2重组表达研究的最终目的。对表达的融合蛋白纯化并切割后收集的重组HBD-2进行了抑菌检测，初步确定了HBD-2重组表达产物对敏感菌E.coli K12 D31有明显抑菌活性。人β防御素-3(HBD-3)和人β防御素-4(HBD-4)与HBD-2同属人β防御素家族。在成功实现HBD-2的大肠杆菌表达的基础上，用经密码子优化的HBD-3和HBD-4成熟肽编码序列作为目的基因，构建了表达载体pET32-smhBD3和pET32-smhBD4，表达所得两目的蛋白分别占细胞总蛋白的33.6％和51.3％且溶解性高达90％。而且发现将HBD-2成熟肽与载体蛋白TRX直接融合也可以实现其在37℃的高可溶性表达。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章文献综述  10-31
  1.1 人防御素  10-21
    1.1.1 人防御素的组织分布  10-11
    1.1.2 人防御素的分子生物学特征  11-16
      1.1.2.1 分子结构  11-13
      1.1.2.2 基因结构及其定位  13-14
      1.1.2.3 基因的表达调控  14-15
      1.1.2.4 翻译后修饰  15-16
    1.1.3 人防御素的抗菌活性及其机理  16-19
      1.1.3.1 抗菌活性  16-18
      1.1.3.2 作用机理  18-19
    1.1.4 人防御素的医学价值及应用前景  19-21
  1.2 人β防御素-2(HBD-2)的重组生产  21-22
    1.2.1 基因工程生产HBD-2存在的问题及解决方法  21-22
  1.3 密码子优化  22-23
  1.4 融合表达  23-31
    1.4.1 pre-pro序列  24
    1.4.2 重复序列  24
    1.4.3 常用的融合表达体系  24-29
    1.4.4 温度对包含体形成的影响  29-31
第二章 HBD-2表达载体的构建  31-42
  2.1 引言  31
  2.2 材料和方法  31-39
    2.2.1 质粒和菌种  31-35
    2.2.2 培养基  35
    2.2.3 工具酶和试剂盒  35-36
    2.2.4 质粒抽提及转化  36
    2.2.5 感受态细胞的制备和质粒转化  36
    2.2.6 DNA的检测  36
    2.2.7 含重复序列的克隆载体和表达载体的构建  36-39
  2.3 克隆载体的鉴定  39
  2.4 表达载体的鉴定  39-41
  2.5 小结  41-42
第三章各种HBD-2表达载体的表达比较  42-56
  3.1 引言  42
  3.2 材料和方法  42-46
    3.2.1 质粒和菌种  42
    3.2.2 培养基  42-43
    3.2.3 培养条件  43
    3.2.4 分析方法  43-46
  3.3 不同重复序列表达载体的表达情况  46-51
    3.3.1 pET28-nshBD2(n=1,2,4,8)为表达载体  46-47
    3.3.2 pQE30-nshBD2(n=1,2,4,8)为表达载体  47
    3.3.3 pBV220-nshBD2(n=1,2,4,8)为表达载体  47-48
    3.3.4 pGEX-nshBD2(n=1,2,4,8)为表达载体  48
    3.3.5 pET32-nshBD2(n=1,2,4,8)为表达载体  48-50
    3.3.6 pMAL-p2-nshBD2(n=1,4)为表达载体  50-51
  3.4 重复序列对宿主菌生长及质粒稳定性的影响  51-54
    3.4.1 重复序列对宿主菌生长的影响  51-53
    3.4.2 重复序列对质粒稳定性的影响  53-54
  3.5 密码子优化对目的蛋白表达的影响  54-55
  3.6 小结  55-56
第四章 E.coli BL21(DE3)／pET32-shBD2发酵条件的研究  56-66
  4.1 引言  56
  4.2 材料与方法  56-57
    4.2.1 菌种  56
    4.2.2 培养基  56
    4.2.3 摇瓶发酵  56-57
    4.2.4 10L发酵罐发酵  57
    4.2.5 分析方法  57
  4.3 摇瓶发酵条件的优化  57-63
    4.3.1 培养基的选择  57
    4.3.2 培养温度  57-60
    4.3.3 摇瓶装液量  60-61
    4.3.4 诱导条件  61-63
  4.4 10L台式发酵罐的间歇发酵  63-64
  4.5 小结  64-66
第五章 HBD-3和HBD-4的重组表达  66-73
  5.1 引言  66
  5.2 材料和方法  66-68
    5.2.1 质粒和菌种  66
    5.2.2 培养基  66
    5.2.3 培养条件  66
    5.2.4 工具酶和试剂盒  66
    5.2.5 基于PCR的基因SOEing合成  66-68
    5.2.6 表达载体的构建  68
    5.2.7 分析方法  68
  5.3 经过密码子优化的HBD-3和HBD-4的基因合成  68-69
  5.4 HBD-3和HBD-4在pET-32a(+)系统中的表达  69-72
  5.5 小结  72-73
第六章 HBD-2的初步活性检测  73-76
  6.1 引言  73
  6.2 材料和方法  73-74
    6.2.1 敏感菌  73
    6.2.2 培养基  73
    6.2.3 固体培养法  73-74
    6.2.4 液体培养法  74
    6.2.5 分析方法  74
  6.3 固体培养法抑菌结果  74-75
  6.4 液体培养法抑菌结果  75
  6.5 小结  75-76
第七章结论  76-77
参考文献  77-84
致谢  84-85
附录  85

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