学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

人细胞增殖相关激酶Plk3/Prk基因的表达及其功能的研究

作　者: 江汕
导　师: 冯振卿
学　校: 南京医科大学
专　业: 病理学
关键词: Plk3/Prk polo蛋白激酶载体构建蛋白表达逆转录病毒基因导入细胞增殖肿瘤
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
下　载: 52次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

人细胞增殖相关激酶Prk(Proliferation-related kinase)，1996年由Wei Dai等首次克隆发现，是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。Prk是polo激酶家族Plks(Polo-like kinases)的新成员，该家族主要包括果蝇的Polo、酿酒酵母的Cdc5p、裂殖酵母的Plol和哺乳动物细胞的四种激酶P1k1、Snk(P1k2)、Prk／Fnk(P1k3)和Sak。Prk基因定位于人类第8号染色体的短臂21区，与家族中的鼠Fnk具有强烈同源性，目前已将Prk命名为P1k3(Polo-like kinase 3)。国外文献报道p1k3基因与家族其它成员一样参与细胞周期的调控，并通过与细胞内有丝分裂器如微管组织中心、中心体和纺锤体的密切联系而对细胞的形态、生存能力及恶性转化发挥作用。P1k3在人体各种组织细胞中的表达具有严格的局限性，正常组织仅在胎盘、卵巢、外周血白细胞和肺组织有中低量表达；体外细胞培养检测仅在一些巨核细胞系的细胞株，如Dami、MO7e和脑神经胶质瘤细胞株中发现。进一步研究表明，P1k3在人肺癌、头颈部鳞癌和大鼠结肠癌组织中的表达明显下调。国外相关研究主要关注P1k3在肿瘤组织中的表达情况，p1k3与其他polo激酶家族成员之间的关系及其调节细胞周期的机制；对于p1k3基因的原核系统表达情况及其在肿瘤细胞水平的研究报道较少。国内目前尚无该基因研究的报道。为了探索在原核系统中表达该真核基因并进一步提纯蛋白的可能性，并且深入研究该基因对肿瘤细胞功能的影响，本课题在参照国外相关研究的基础上，设计并完成了以下工作： 1．体外扩增p1k3基因的cDNA，经亚克隆、测序鉴定其序列。构建p1k3基因的原核非融合表达系统和融合表达系统，分别运用温控和由京医科大学颀十学位论文药物诱导方式表达Plk3蛋白。分析比较二者在Plk3蛋白表达上的差异，以选择合适的蛋白表达体系用于进一步单抗的制备。 2．构建plk3基因的重组逆转录病毒载体，并将重组载体DNA导入逆转录病毒包装细胞中，收集产生的病毒上清；通过逆转录病毒转染法将 plk3基因导x K562和 HL60肿瘤f田胞，进一步筛选鉴定获得全部表达plk3基因的肿瘤细胞；以野生型肿瘤细胞为对照，分析比较plk3基因的稳定表达对肿瘤细胞生长增殖能力以及体内成瘤能力的影响。研究方法采用 PCR体外扩增技术，设计引物扩增全长 plk3 CDNA片段，filA连接亚克隆至州D18＊载体，测序并进行限制性酶切图谱分析。采用质粒抽提、纯化、酶切、连接、感受态细胞制备和转化等技术，构建并鉴定原核表达载体。根据原核表达载体的特点分别采用温控和药物诱导两种方式诱导Plk3蛋白的表达并分析蛋白表达的结果。同样方法首先构建p比3基因的亚克隆T载体pUCll＊ghk3，再通过上述DNA重组技术将plk3基因重组入逆转录病毒载体。大量抽提纯化重组病毒质粒，采用DNA一磷酸钙共沉淀法将重组质粒导入逆转录病毒包装细胞。常规方法大量培养该包装细胞，收集细胞产生的病毒上清，采用1．asRT法测定病毒滴度，用高滴度病毒分别转染肿瘤细胞K562和HL60。通过克隆形成实验、MTT法测定生长曲线、流式细胞检测等技术观察并分析肿瘤细胞的生长增殖能力、细胞周期和细胞凋亡情况。再通过接种K562和K562卡lk3 i则胞至保鼠体内观察t匕较肿瘤结节的生长情况。研究结果体外扩增并鉴定出约 1．85kb的全长plk3 CDNA片段。成功构建了原核非融合蛋白表达系统pBV220ghk3 和融合蛋白表达系统 lh 0：［X科大学佝卜l：学位论文pET－24a＋）plk3，并分别在大肠杆菌 DHS a和 BL－ZI（DE3）中诱导获得表达量较低的非融合表达蛋白门．9O）和表达量相对较高的N一末端带有6个连续组氨酸的重组融合表达蛋白门5％L 初步纯化的结果显示非融合表达的蛋白主要集中在菌液上清中，而融合表达的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多。成功构建了逆转录病毒载体系统 pMSCV个uroghk3，经293T－Amphotropic全月包装产生浓度在 5石 x 10’叫石8 x 10‘CFU／ml白病毒。通过逆转录病毒介导基因导入；筛选鉴定获得K562巾lk3和HL60－plk3兰胞系。与未转基因勺肿瘤i田胞t匕较，plk3基因勺导入使肿瘤细胞增殖速度减慢，细胞周期发生改变。体内实验初步显示K562细胞在plk3基因导入后成瘤缓慢，成瘤体积下降。结论 l．人细胞增殖相关激酶plk3巾rk基因可经原核非融合表达体系和融合表达体系获得表达，蛋白表达的条件、量和方式各有特点。本部分研究为进一步获取纯化蛋白制备单抗提供了选择依据。 2．plk3／prk基因可能是一种肿瘤抑制因子，青＊制月瘤细月K562和HL6O的增殖；并降低K562细胞的裸鼠体内成瘤能力。本部分研究对于plk3中rk基因功能的认识及其将来在抗肿瘤治疗中的应用具有重要参考价值。

全文目录

中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
前言  12-14
正文  14-59
  第一部分 P1k3／Prk基因的体外扩增、原核表达载体的构建与表达  14-37
    材料和方法  14-28
    结果  28-35
    分析与讨论  35-37
  第二部分 P1k3／Prk基因逆转录病毒载体的构建及其在肿瘤细胞中功能的研究  37-59
    材料和方法  37-48
    结果  48-55
    分析与讨论  55-59
小结  59-60
参考文献  60-63
致谢  63-64
综述  64-73
附页(就读期间撰写文章)  73

人细胞增殖相关激酶Plk3/Prk基因的表达及其功能的研究

内容摘要

全文目录

相似论文