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UVB诱导的细胞凋亡中microRNA作用机制的初步研究

作　者: 何英杰
导　师: 丁振华
学　校: 南方医科大学
专　业: 放射医学
关键词: let-7 miR-21 miR-24 microRNA UVB 凋亡
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景紫外线(ultraviolet, UV)是电磁波谱中波长为100-400nm的辐射的总称。人类社会活动中的紫外线来源主要是太阳及少量的人工光源,而太阳光谱中,紫外线约占5%。根据国际通行的分类方法,UVB是指波长为280-315nm的中波紫外线。太阳光谱中除UVB外,还有短波紫外线UVC和长波紫外线UVA。但太阳光中的UVC在经过地球大气层时几乎全被臭氧层吸收,不能到达地球表面对人体产生作用；UVA约占到达地面的太阳光紫外线的95%,对衣物和人体皮肤的穿透性强,可达到真皮层处。它可对皮肤中黑色素起作用,引起色素沉着并使皮肤变黑,反过来起到防御紫外线保护皮肤的作用。本研究关注的UVB虽然在太阳光紫外线中含量较少,只占到达地球的紫外线的4%-5%,却是活性最强的组成部分。它致皮肤日光灼伤的能力是UVA的1000倍,比UVA更具有遗传毒性,能够诱导形成环丁烷-嘧啶二聚体和嘧啶-嘧啶酮光产物,造成细胞内DNA的直接损伤,进一步导致凋亡、变异的发生。虽然到达地球的UVB只占太阳光中全部到达地球的紫外线的4%-5%,但是它的波长正好在DNA和蛋白质的吸收峰附近,可以引起DNA和蛋白质的损伤。而且,随着近年来人类活动对地球大气臭氧层的破坏加剧,紫外线对人体的损伤作用日益受到人们的重视。但是目前人们对紫外线诱导的DNA损伤、细胞周期阻滞及凋亡的分子机制的研究仍多限于蛋白编码基因,而非蛋白编码基因microRNA基因是否也在紫外线导致损伤的机制中发挥作用少见报道。microRNA是一类大小为22nt左右的非编码单链小分子RNA,最初于1993年由研究人员在研究果蝇发育的时序性调控过程中发现。最先发现的microRNA只有lin-4和let-7,随着近年来研究的深入,人们发现了越来越多的microRNA分子。虽然逐步明白了它们参与调节细胞周期、信号转导、细胞凋亡和增殖分化等诸多生物学过程以及某些疾病诸如肿瘤和代谢性疾病的发生和发展的一些机制,但是未知仍然远大于已知。根据本实验室Guo L等人利用微阵列芯片对UVB照射后NIH3T3细胞microRNA差异表达的研究结果,NIH3T3细胞在UVB照射后不同的时间点,细胞内数十种microRNA分子均出现了不同程度的表达上调或下调。考虑到微阵列芯片技术虽然具有高通量、操作简便等优点,但是也具有敏感性和特异性不高的缺点,因此我们选择其中的let-7、miR-21和miR-24三种对UVB敏感的microRNA分子,用不同的实验方法对其是否参与紫外线诱导的细胞凋亡进行了初步的研究。研究目的对microRNA分子let-7、miR-21和miR-24是否参与紫外线诱导的细胞凋亡进行初步研究,观察细胞内let-7、miR-21和miR-24的表达水平在UVB诱导的细胞凋亡中的变化情况,推论其在细胞凋亡中的促进或抑制作用,并通过靶基因预测软件,初步预测它们在细胞凋亡信号转导通路中的作用机制。研究方法1. NIH3T3细胞和HaCaT细胞的体外培养NIH3T3细胞和HaCaT细胞分别在含有10%小牛血清的MEM和DMEM培养液中,于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。2. NIH3T3细胞和HaCaT细胞的UVB照射用紫外灯对NIH3T3细胞和HaCaT细胞进行照射。紫外灯为上海市计量测试技术研究院生产,并经上海市计量局检测,其发射的紫外线波峰为305nm,照射时光源距样品垂直距离为40cm,此距离的紫外灯功率为16.5μW／m2。细胞照射前弃去培养基,PBS清洗两遍后,加入与培养基等体积的PBS、移开培养皿盖子进行照射。照后将PBS置换成新鲜培养基,细胞继续培养,待检测各项指标。3. Hoechest33342/PI染色观察NIH3T3细胞凋亡NIH3T3细胞经UVB照射后(对照组无照射)继续培养12h, PBS清洗2次,按照Vybrant(?) Apoptosis Assay Kit #7试剂盒(美国Invitrogen公司,Cat#V-23201, Molecular Probes)进行操作。在荧光显微镜下观察细胞形态并摄片。4.MTT和流式细胞术检测HaCaT细胞UVB照射后的形态学变化进行MTT检测的HaCaT细胞接种在96孔板中200μl／孔,10 OOOcells/孔；行流式细胞技术检测的细胞接种在直径为80mm的培养皿中。HaCaT细胞照射分组按两种方式进行：(1)按细胞受照剂量(受照时间)不同,分为对照组和不同剂量的照射组,照后继续培养12h进行检测；(2)按细胞照射后培养时间不同,分为对照组和照射后培养不同时间的照射组。对于MTT实验,各组细胞到培养时间点后,向各孔细胞培养基内加入MTT使其终浓度为0.5mg/ml。继续孵育4-6h,弃尽培养基,用DMSO完全溶解甲臜颗粒,用酶标仪测定OD值。对于流式细胞技术,各组细胞到培养时间点后,收集培养皿中细胞,经PBS洗涤后用预冷的70%乙醇4℃固定至少24h,然后使用终浓度为100μg/ml的PI和100μg/ml的RNaseA染色、检测。5. NIH3T3细胞microRNA及HaCaT细胞总RNA的提取NIH3T3细胞照射5min后,置于5%CO2的孵育箱中继续培养。12h后弃上清,PBS清洗2次。Hacat细胞继续培养2h,4h,8h,12h和24h后,NIH3T3细胞小RNA和HaCaT细胞总RNA均按照试剂盒mirVanaTM microRNA Isolation (Cat#1560, Ambion)的操作步骤提取。6.PCR检验let-7和miR-24的表达Mmu-let-7、mmu-miR-24和5S的引物购于Ambion公司。在反应管中加入提取的small RNA、oligo dT Primer, Random 6 mers及逆转录酶合成第一链,反应条件为37℃30min；95℃10min。取5μl的逆转录产物进行PCR扩增,扩增产物大小为90bp。反应条件为95℃预变性3min；95℃变性60 sec；60℃退火30 sec,40个循环。以5S为内参照在同一反应管内同步扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离与DNA分子量Marker进行比较。7. Real-time PCR检验miR-21的表达miR-21的引物和内参U6的引物购自ABI公司(Cat#4373194,Cat#4373381),应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Cat#4366596)和TaqMan Universal PCR Master Mix试剂盒(Cat#4324018)进行逆转录反应并在Stratagene MX3000P上进行Real-time PCR,反应条件如下：37℃反应30min、95℃孵育10min,95℃15sec,60℃1min进行逆转录反应；95℃预变性3min；95℃变性60sec；60℃退火30sec,40个循环进行扩增。扩增结束记录各模板Ct值,将同一样本中目的基因的Ct值与内参基因的Ct值相减,所得出的△Ct为目的基因相对于内参基因的表达强度,即△Ct=目的基因Ct-内参基因Ct。计算△△Ct,△△Ct=处理样本△Ct-未处理样本△Ct,再使用2-ΔΔCt方法将目的基因的表达差异通过处理样本相对于未处理样本的倍数来表示。2-ΔΔCt>1,目的基因表达上调,反之下调。8. Real-time PCR检验miR-21的表达的统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量资料数据采用均数±标准差(X±S)来表示,荧光定量PCR结果ΔCt值的比较采用One-way ANOVA,6个时间点的细胞ΔCt值的多重比较采用SNK法(Student-Neuman-Keuls)。9.let-7、miR-21和miR-24靶基因的预测及生物信息学分析以let-7、miR-21和miR-24为检索词,在MicroCosm、PicTar和Targetscan三个数据库进行靶基因预测,将分别预测的结果取交集,即得到预测的可信度和准确性相对较高的靶基因。将取交集后得到的靶基因进行初步的基因功能分析(Gene Ontology enrichment analysis),概括靶基因主要发挥的生物学功能。研究结果1. Hoechest33342/PI染色观察NIH3T3细胞凋亡NIH3T3细胞照射后经Hoechst33342/PI染色,对照组以正常细胞居多,荧光染色很浅,染色质均匀,核形态规则；而当UVB照射5min后,则可见典型的凋亡和坏死细胞。凋亡细胞主要摄取Hoechst染料,呈现强蓝色荧光,细胞核固缩核染色质边集荧光信号强；而坏死细胞主要摄取PI而呈强红色荧光。2.PCR检验let-7和miR-24的表达let-7和miR-24在UVB照射组和未照射组NIH3T3细胞中均有表达,但是在UVB照射组的NIH3T3细胞中表达水平明显高于未照射组。3.UVB照射后HaCaT细胞的形态学改变(MTT法和流式细胞术)MTT法检测HaCaT细胞UVB受照后生存率,结果显示,无论是随细胞受照剂量增大,还是随细胞照射后培养时间的延长,细胞的生存率均越来越低。流式细胞技术检测细胞周期的结果显示,经不同剂量的UVB照射和照射后培养不同时间的细胞都出现不同程度的细胞周期阻滞。4. Real-time PCR检验miR-21的表达及统计学分析miR-21在经UVB照射后HaCaT细胞中,在2-4h内,其表达水平是升高的,在随后的8h,其表达水平与对照组相比降低了一半。采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量资料数据采用均数±标准差(X±S)表示,荧光定量PCR结果ΔCt值的比较采用One-way ANOVA, P<0.05,差异具有统计学意义。多重比较后发现miR-21在对照组和照后2h、4h、8h和12h之间有显著差异。但是运用2-ΔΔCt方法检测microRNA的表达水平差异时,只要2-ΔΔCt的数值改变达到2倍以上,便可说明差异有显著意义,即miR-21在对照组和照射后2h、4h、8h组之间的表达差异显著。5.let-7、miR-21和miR-24靶基因的预测及生物信息学分析我们利用MicroCosm、PicTar和Targetscan等软件分别对let-7、miR-21和miR-24的靶基因进行预测并对预测结果进行了功能分类,从中我们可以看出casp3、bcl2、bcl212、map3k1、cdk5、pik3r1、e2f3等基因参与了细胞的分化及细胞的周期进程,同时它们也是UVB所致损伤的分子机制的重要基因,据此我们可以推断,microRNA也参与了UVB所致损伤的分子机制。结论通过对未经UVB照射和被UVB照射过以及UVB照射后不同时间的细胞中microRNA分子let-7、miR-21和miR-24的表达水平进行研究,我们初步推断let-7、miR-21和miR-24参与了UVB诱导的细胞凋亡,在细胞凋亡过程中发挥了作用。研究结果显示,在受到50J/m2的UVB照射后,NIH3T3细胞中let-7的表达量有明显的增加。而此时细胞受UVB照射后发生了一定程度的凋亡,这提示let-7可能参与UVB诱导的细胞凋亡的分子机制。miR-24在受到紫外线照射的NIH3T3细胞中表达量也增高,初步说明let-7和miR-24具有促凋亡的作用。而对于miR-21,发现它在受UVB照射后凋亡的HaCaT细胞中的表达变化是时间依赖性的。在照射后2h的HaCat细胞中其表达水平升高的倍数最大,为未照射的对照组细胞的6倍,4h时为5倍,而在8h时,其表达水平降低1/2以上,12h以后其表达水平改变不明显。我们进一步运用生物信息学的方法对let-7、miR-21和miR-24的靶基因进行预测和分类,从预测结果可以看到Casp3、Bcl2、Bcl212、Map3k1、Cdk5、Pik3r1、E2f3等参与了细胞的分化及细胞周期进程的基因,从let-7和miR-24的靶基因分析,可以看到其靶基因与UVB诱导损伤的靶基因有大量重合,据此初步推断microRNA参与了UVB诱导的细胞凋亡等损伤的分子机制。

全文目录

摘要  3-10
ABSTRACT  10-19
前言  19-23
第1章 let-7和miR-24在UVB诱导的NIH3T3细胞凋亡中的表达  23-33
  1.1 材料与方法  23-29
  1.2 结果  29-30
  1.3 讨论  30-33
第2章 miR-21在UVB诱导的HaCaT细胞凋亡中的表达  33-48
  2.1 材料与方法  33-41
  2.2 结果  41-46
  2.3 讨论  46-48
第3章 let-7、miR-21和miR-24的靶基因预测及生物信息学分析  48-54
  3.1 材料和方法  48-49
  3.2 结果  49-51
  3.3 讨论  51-54
结论  54-57
参考文献  57-61
附录1·综述  61-70
附录2·中英文缩略词表  70-71
附录3·学位论文统计学处理合格证明  71-72
成果·在读期间发表的论文  72-73
致谢  73-75

UVB诱导的细胞凋亡中microRNA作用机制的初步研究

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