发根农杆菌Ri质粒转化烟草的各种影响因素，确定了最佳的转化条件，建立了烟草发根培养系统：对发根与非转化根的形态结构、生长动态进行了研究，并以Ri质粒T-DNA上的rolC基因设计引物，对发根进行了分子检测，利用GUS报告基因检测了外源基因" />

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Ri质粒转化的烟草发状根培养及其烟碱生物合成调控的研究

作　者: 宋志红
导　师: 刘国顺；崔红
学　校: 河南农业大学
专　业: 作物栽培学与耕作学
关键词: 烟草烟碱发根农杆菌发根 Ri质粒悬浮培养
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

本试验研究了发根农杆菌的学位论文">发根农杆菌Ri质粒转化烟草的各种影响因素，确定了最佳的转化条件，建立了烟草发根培养系统：对发根与非转化根的形态结构、生长动态进行了研究，并以Ri质粒T-DNA上的rolC基因设计引物，对发根进行了分子检测，利用GUS报告基因检测了外源基因在发根和再生植株上的表达，为发根遗传转化提供了可靠的分子证据；并在悬浮条件下，进行了不同理化因子对烟草毛状根生长和烟碱合成调控的研究。主要结果如下： 1．本研究通过发根农杆菌工程菌LBA1334(含有野生型pRi1855质粒和pIG121HM双元载体质粒，编码NPTⅡ基因和GUS基因)转化烟草沙姆逊，获得了具有卡那霉素抗性烟草发状根，并筛选出良好的单克隆株系，该发状根具有典型的发状根特性(多根毛、多分支、在无激素培养基上快速生长)，通过根尖压片分析，烟草发状根不具备典型的根冠；发状根中烟碱含量1.61％稍高于与天然栽培品种母体根的含量(1.5％左右)，发状根向培养液中释放烟碱，释放量最多时占总烟碱量的81.1％；在无激素的培养基上获得了再生植株。 2．以Ri质粒T-DNA上的rolC基因设计特异引物，对发状根进行PCR扩增，得到了560bp的目的基因片段，证明了Ri质粒在烟草发状根的基因组中得到了整合：本试验还对烟草发状根和再生植株叶片进行了GUS组织化学检测，在烟草发状根中和再生植株叶片中检测到兰色反应，说明了GUS基因在烟草发状根和再生植株中得到表达。以上检测结果表明烟草发状根体系作为载体进行外源基因表达生产目的产物以及进行烟草品种改良的可能性。 3．对烟草发状根诱导的影响因子(诸如发根农杆菌菌株、烟草品种、叶片程度、菌液浓度、稀释倍数、浸染时间、共培养时间等)进行了研究，确定出最佳的组合条件：以发根农杆菌工程菌株LBA1334和沙姆逊为转化体系，选取上部幼嫩的组培苗叶片，在稀释5上0倍的对数生长期菌液（OD60斤0个0．8）中浸泡5分钟，共培养2大，进行脱菌筛选培养，可获得高的转化效率。 4．悬浮培养中发根的生长和物质合成受多种理化因子的影响（培养基、pH 值、装液量、蔗糖浓度、添加物等）的影响，本实验中，以 1o 液体为Z 培养基，蔗糖20上0g／L，pH值6刀，装液量为容器体积的2／5，可添加水解酪蛋白Q）和 IAA门人在 27”C，11 orpm下暗培养，25天左右收获发状根，可达最佳效果。 5．烟草发状根培养中，激素对发状根生长和烟碱合成有较大影响。赤霉素（GA3）可显著增加发状根的生长量，但抑制烟碱的生成；u跺乙酸uAA）在合适浓度门mg／L）即能增加发状根的生长又能促进烟碱的合成；＃乙酸（NAA）对发状根生长量和烟碱的生成无明显促进作用。 6．通过对烟草发状根培养液pH值的研究，表明烟草发状根在培养的最初8 大内，培养液pH值变化到5刀左右，一直维持到悬浮培养后期；收获时培养液pH值与发状根生物总量呈显著的正相关。

全文目录

致谢  3-7
英汉对照及缩略语  7-8
摘要  8-10
1 文献综述  10-23
  1.1 植物次生代谢产物及利用  10-11
  1.2 Ri质粒及发根特性  11-14
    1.2.1 Ri质粒  11-13
    1.2.2 Ri质粒的转化方法  13-14
    1.2.3 发状根的特性  14
  1.3 利用发根培养生产次生代谢物质  14-20
    1.3.1 利用发根培养建立的次生代谢物质培养体系  14-18
    1.3.2 发根培养技术生产次生代谢物质的最新研究进展  18-20
  1.4 烟草发根的研究进展  20-23
2 引言  23-24
3 材料与方法  24-29
  3.1 材料  24
  3.2 试验方法  24-29
    3.2.1 无菌苗的培养  24
    3.2.2 发根固体培养  24
    3.2.3 发根液体培养  24
    3.2.4 发根农杆菌菌液制备  24-25
    3.2.5 共转化  25
    3.2.6 植物基因组DNA提取与纯化  25-26
    3.2.7 质粒DNA提取与纯化  26
    3.2.8 烟草发状根的PCR鉴定  26-27
    3.2.9 GUS基因组织化学检测  27-28
    3.2.10 根尖压片分析  28
    3.2.11 发根生长动态测定  28
    3.2.12 发根烟碱含量测定  28-29
4 结果和分析  29-46
  4.1 Ri质粒转化烟草的研究  29-32
    4.1.1 发根农杆菌种类、烟草品种对发根转化的影响  29
    4.1.2 发根农杆菌生理状态及浓度的影响  29-30
    4.1.3 叶片发育时期的影响  30-31
    4.1.4 叶片浸泡时间、共培养时间的影响  31-32
    4.1.5 乙酰丁香酮的影响  32
  4.2 发状根的形态观察与植株再生  32-33
  4.3 烟草发状根的分子检测  33-34
    4.3.1 烟草发状根的PCR检测  33-34
    4.3.2 发状根及再生叶片的GUS组织化学检测  34
  4.4 不同理化因子对发根生长及烟碱合成的调控的研究  34-46
    4.4.1 烟草发状根生长动态曲线  34-35
    4.4.2 装液量对发根生长和烟碱含量的影响  35-36
    4.4.3 蔗糖浓度的影响  36
    4.4.4 不同培养基的影响  36-37
    4.4.5 有机添加物的影响  37-38
      4.4.5.1 水解酪蛋白的影响  37-38
      4.4.5.2 酵母提取物的影响  38
    4.4.6 激素的影响  38-43
      4.4.6.1 GA3的影响  38-40
      4.4.6.2 IAA的影响  40-41
      4.4.6.3 NAA的影响  41-43
    4.4.7 发根悬浮培养液体培养基PH值的研究  43-46
      4.4.7.1 发根生长中液体培养基PH值的变化  43-44
      4.4.7.2 不同PH值处理的发根生长量和烟碱含量的比较  44-45
      4.4.7.3 培养液PH值与发状根重量关系的研究  45-46
5 讨论  46-50
  5.1 烟草发状根的比较研究  46
  5.2 烟草发状根的分子检测  46-47
  5.3 发根农杆菌对烟草转化因素影响的研究  47-48
  5.4 各种理化因子对烟草发根生长和烟碱合成的影响  48-49
  5.5 需要进一步开展的工作  49-50
6 结论  50-51
参考文献  51-55
英文摘要  55-56

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