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防治土传烟草黑胫病微生物有机肥的研制与生物效应研究

作　者: 曹明慧
导　师: 沈其荣；杨兴明
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物营养学
关键词: 烟草黑胫病微生物有机肥多粘类芽孢杆菌烟草疫霉
分类号: S435.72
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

烟草黑胫病是烟草产生连作障碍的主要病害之一,其病原菌为疫霉菌Phytophthora parasitica var. nicotianae,该病害的防治方法已成为烟草生产的研究热点。生物防治是目前研究克服土传病害的重要途径之一,因为生物防治具有抗病和环保的作用,而获得高效拮抗菌株是进行生物防治研究的基础。本研究从云南和安徽黑胫病重病烟田中采集健康植株根际土壤,从中共分离出细菌289株,通过平板对峙法从中筛选出对烟草疫霉(Phytophthora parasitica var. nicotianae)具有拮抗作用的12株细菌,抑菌率59.4%～71.1%；其中C-5菌株的拮抗活性最高,抑菌率为71.1%,抑菌直径达到2.8 cm。C-5菌株不仅对烟草黑胫病病原菌有较强的拮抗作用,同时对其他多种病原菌也具有拮抗作用,抑菌率均达53.3%以上。其中对甜瓜枯萎病病原菌的抑菌率高达73.3%；对青椒疫病、棉花枯萎病病原菌的抑菌率为66.7%和66.8%；对香蕉、黄瓜枯萎病以及黄瓜立枯病病原菌的抑菌率达53.3～55.0%；而对西瓜枯萎病病原菌却没有抑制作用。采用传统的细菌系统鉴定方法鉴定拮抗菌株C-5,结果发现它与多粘芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌都很相似,但无法精确确定其分类地位。采用16S rDNA序列分析法从分子角度确定菌株C-5的分类地位,结果表明菌株C-5与多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)的同源性为100%,最终鉴定其为多粘类芽孢杆菌。通过对C-5产酶能力的研究发现,菌株C-5具有产纤维素酶和蛋白酶的能力。其中产蛋白酶的水解圈达到23mm,产纤维素酶的水解圈达到3.3 mm,这可能在抗真菌上发挥一定的作用,当然,这并不排除其他酶或未知拮抗成分也在拮抗过程中发挥着作用。对菌株C-5的培养条件进行的初步测定结果表明,菌株C-5在30℃、pH 7.0、装液量为20%条件下生长最好,其最适碳源和氮源分别为蔗糖、蛋白胨,葡萄糖和硫酸铵次之。盆栽试验证明：利用C-5菌株制备的微生物有机肥能有效防治烟草黑胫病的发生,苗期防治率达80%；C-5菌株及其微生物有机肥的使用能改变根际土壤的微生物区系,和连作土壤(CK2)相比,使用微生物有机肥处理(MOF)和单加拮抗菌处理(ANT)的土壤中真菌数量减少,细菌和放线菌数量有显著增加。其中,细菌分别为CK2的2.4倍、3.5倍左右；放线菌为CK2的4.4倍左右、11.9倍左右。与CK2相比,MOF的鲜重、干重和株高分别增加约1.8倍、1.7倍和1.4倍；MOF与健康土处理(CK1)的鲜重和株高也有显著差异,分别增加1.4倍和1.3倍；MOF与OF的鲜重和株高有明显差异,分别约增加1.4倍和1.2倍,干重增加1.4倍。说明C-5对烟草具有促生作用,能提高烟草的产量。

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摘要 8-10ABSTRACT 10-12第一章文献综述 12-22 1.1 烟草黑胫病概述 12-15 1.1.1 烟草黑胫病的分布与危害 12 1.1.2 烟草黑胫病的症状 12 1.1.3 烟草黑胫病病原菌的命名与分类地位 12-13 1.1.4 烟草黑胫病病原菌的生物学特性 13-14 1.1.5 烟草黑胫病病原菌的生理学特征 14 1.1.6 黑胫病病菌侵染循环及侵染机理 14-15 1.2 烟草黑胫病的综合防治 15-17 1.2.1 种植抗病品种和抗病育种 15-16 1.2.2 农业措施防治 16 1.2.3 化学防治 16-17 1.3 烟草黑胫病生物防治的研究动态 17-20 1.3.1 细菌类、放线菌类生防菌对烟草黑胫病的控制作用 17-18 1.3.2 真菌类生防菌对烟草黑胫病的控制作用 18-19 1.3.3 筛选细胞突变体来抑制烟草黑胫病 19 1.3.4 通过诱导抗性防治烟草黑胫病 19-20 1.3.5 烟草黑胫病的其它生物防治方法 20 1.4 本文研究的目的和意义 20-21 1.5 技术路线 21-22第二章烟草黑胫病拮抗细菌的分离、筛选 22-30 2.1 材料 22-23 2.1.1 土壤 22 2.1.2 供试病原菌株 22 2.1.3 培养基 22-23 2.2 方法 23-24 2.2.1 病原菌孢子液的制备 23 2.2.2 病原菌的回接验证 23 2.2.3 样品的采集 23 2.2.4 拮抗菌株的分离 23-24 2.2.5 拮抗菌株的筛选 24 2.2.6 抑菌谱试验 24 2.2.7 数据处理 24 2.3 结果与分析 24-28 2.3.1 病原菌回接试验结果 24-26 2.3.2 拮抗细菌的平板初筛结果 26-27 2.3.3 C-5菌株抑菌谱测定 27-28 2.4 讨论 28-30第三章拮抗细菌C-5的鉴定 30-46 3.1 拮抗菌C-5的表型和生化鉴定 30 3.1.1 形态观察和革兰氏染色 30 3.1.2 芽孢染色 30 3.2 生理生化特征测定 30-32 3.2.1 过氧化氢酶的测定 30 3.2.2 甲基红反应(M.R试验) 30-31 3.2.3 乙酰甲基甲醇试验(V.P试验) 31 3.2.4 淀粉水解 31 3.2.5 从甘油产生二羟基丙酮 31 3.2.6 明胶水解 31-32 3.2.7 在pH5.7的营养肉汤上的生长 32 3.2.8 耐盐性试验 32 3.2.9 糖或醇类发酵试验 32 3.3 几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶活性定性测定 32-33 3.3.1 C-5产几丁质酶能力的测定 32 3.3.2 C-5产纤维素酶能力的测定 32-33 3.3.3 C-5产蛋白酶能力的测定 33 3.4 菌株的16S RDNA序列的测定和鉴定 33-35 3.5 结果与分析 35-43 3.5.1 菌体形态观察与描述 35-36 3.5.2 生理生化特性的测定 36 3.5.3 几丁质酶、纤维素酶和蛋白酶活性定性测定 36-37 3.5.4 温度对菌株C-5生长的影响 37-38 3.5.5 pH值对菌株C-5生长的影响 38-39 3.5.6 通气量对菌株C-5生长的影响 39 3.5.7 碳源对C-5生长的影响 39-40 3.5.8 氮源对C-5生长的影响 40-41 3.5.9 C-5菌株的16S rDNA全序列测定及分析 41-43 3.6 讨论 43-46第四章拮抗菌株C-5对烟草黑胫病的防治和烟草生长的影响 46-52 4.1 材料 46-47 4.1.1 拮抗菌C-5菌悬液的制备 46 4.1.2 供试育苗基质 46 4.1.3 供试土壤 46 4.1.4 供试有机肥 46 4.1.5 供试烟草品种 46 4.1.6 盆栽试验方案 46-47 4.2 测定方法 47-48 4.2.1 植株地上高度测定 47 4.2.2 植株地上部分鲜重及干重 47 4.2.3 土壤根际微生物区系的测定 47-48 4.3 结果与分析 48-50 4.3.1 拮抗菌和有机肥结合施用对烟草苗期生长的影响 48-49 4.3.2 拮抗菌和有机肥结合施用对烟草苗期黑胫病的防治效果 49-50 4.3.3 拮抗菌及施有机肥对烟草连作土壤微生物区系的影响 50 4.4 讨论 50-52第五章全文总结 52-54参考文献 54-62致谢 62-64作者简介 64在读硕士期间发表的论文 64

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